عزل الخمائر من مياه أنهار مختلفة في محافظة البصرة وتشخيصها بتقنية جهاز فايتک

                                                                           Vitek 2 compact system 

   د. سناء قاسم بدر  و د. باسل عبد الزهرة عباس

الملخص العربي :

إستهدفت الدراسة الحالية عزل وتشخيص الخمائر المنتشرة فى مياه ورواسب خمسة وعشرين نهرا فى محافظة البصرة بالعراق وذلک فى الفترة من شهر نيسان 2014 إلى شهر شباط 2015. وقد أستخدم لعزل الخمائر الوسط المزرعى المکون من البطاطس والکسترور والأجار  (PDA) بعد ترشيح عينات المياه أو تخفيف الرواسب. وأمکن الحصول على 300 عزلة نقية من الخمائر تم تشخيصها بتقنية حديثة بإستخدام جهاز Vitek 2 Compact system بعد تحميل کروت التعريف بمعلق الخلايا الحية للخمائر. أسفرت النتائج عن عزل وتعريف 300 سلالة من الخمائر تم تصنيفها إلى 15 نوعا تنتمى إلى 5 أجناس هي: Candida, Cryptococcus, Kloeckera, Rhodotorula, Stephanoascus

وأظهرت النتائج أن نوع Candida tropicalis هو الأکثر ترددا بين الأنواع المعزولة وقد بلغت نسبة التردد 36.3 % وأما نوع Candida lipolytica فکان الأقل ترددا إذ سجل نسبة تردد بلغت 0.7 %.  وفيما يخص المواقع الغنية بالخمائر کان موقع المعقل -1 هو الأکثر ثراء إذ بلغ عدد المستعمرات 21  مستعمرة   بينما سجل موقع المدينة اقل عدد من هذه الخمائر (6 مستعمرات فقط).

الکلمات المفتاحية :- الخمائر- أنهار البصرة – کانديدا Vitek -2, Candida,   .

المقدمة

الخميرة هي کائنات مجهرية حقيقية النواة من مملکة الفطريات، وفيها نحو 1500 صنفا. ومعظمها يتکاثر لا جنسياً. يستعمل الإنسان الخميرة في الخبز وتصنيع المشروبات الکحولية.  تتکون الخميرة المُستخدمة تجاريًا من تجمعات من کائنات الخميرة المجهرية أحادية الخلية. وعلى الرغم من وجود أکثر من 600 نوع من الخمائر إلا أن القليل منها فقط له استخدامات تجارية.

کان الإنسان حتى عام 1876م يصنع الخبز والجعة والنبيذ بدون أن يتفهّم أو يعي الدور الذي تؤديه الخميرة في صناعة هذه المنتجات. وفي ذلک العام (1876م)، أفاد العالم الفرنسي لويس باستير أن الخميرة کائن حي وأنها تؤدي دورًا مهمًا في صناعة البيرة.

تتکاثر الخميرة بسرعة وتنمو بدرجة جيدة خاصة في البيئة المحتوية على سُکَّر. تتکاثر الخميرة بالانقسام (انقسام الخلية الواحدة إلى خليتين) أو بالتبرعم. وأثناء التبرعم ينتفخ جزء من جدار الخلية

ويُکوِّن نموًا جديدًا يُسمى البرعم. وينفصل هذا البرعم بعد ذلک ويکون خلية جديدة مستقلة.

تفتقر فطريات الخميرة إلى الکلوروفيل (مادة اليخضور)، وهي المادة الخضراء التي يستخدمها النبات لتکوين غذائه. لذلک، فإن الخميرة تعتمد على مصادر خارجية للحصول على الغذاء. تتغذى الخميرة بالسکر الناتج من المصادر الطبيعية المختلفة مثل الفاکهة والحبوب والعصائر والمولاس. تُنتِج خلايا الخميرة مرکبات کيميائية تُسمى إنزيمات، أو مخمرات، لها القدرة على تحليل غذاء الخميرة. تنتج أنواع مختلفة من الخمائر أنواعًا مختلفة من الإنزيمات. وبعض الإنزيمات تُکسِّر السکَّريات إلى کحول وغاز ثاني أکسيد الکربون أثناء عملية التخمر (Balasubramanian et al., 2004).

يعتبر جهاز VITEK 2 COMPACTSYSTEM والمدمجة - إنتاج شرکات بيوفارما مثاليا للتشخيص الروتيني للميکروبات حيث يضمن التميز وحسن تدفق العمل وهو مزود بقاعدة البيانات الخاصة به والتى تمکن VITEK® 2 من تشخيص مجموعة کبيرة من الکائنات الحية الدقيقة تتميز بالاتي :-

• ·  سير العمل الأمثل لجميع المراحل، من القراءة   لتسجيل النتائج

التتبع الکامل: يتم التقليل من مخاطر أخطاء النسخ تعتمد کفاءة نظام ضغط VITEK® 2 على التکنولوجيا المتقدمة لقياس الألوان حيث يقوم النظام بقراءة أحدث بطاقات اختبار الجيل VITEK والتى تحتوي على 64 بئرا لضمان الدقة - کل 15 دقيقة بإستخدام ثلاث موجات مختلفة مع هذه التقنية ويمکن تحليل المزيد من البيانات، مما يزيد من دقة النتائج.

المواد وطرق العمل :-

جمع العينات وزرعها :

جمعت خلال الدراسة 125 عينة ماء و125 عينة رواسب طينية وذلک من 25 نهرا فى مواقع مختلفة بمحافظة البصرة کما هو موضح بالجدول رقم (1) وکانت فترة الجمع من شهر نيسان 2014 لغاية شهر شباط 2015 بواقع خمس مکررات لکل نهر(ماء + رواسب طينية ), وکان الجمع فيما يخص عينات الماء بواسطة قناني زجاجية سعة 100 مل معقمة ويکون اخذ العينة على عمق 30 سم وأما عينات الرواسب الطينية فقد وضعت فى أکياس نايلون معقمة وتم اخذ العينة من جرف النهر من سطح التربة مرة ومن عمق 30 سم مرة أخرى .

تم زرع العينات حسب نوع العينة حيث تزرع العينات المائية بطريقة الترشيح وذلک بترشيح 50 مل من ماء العينة بواسطة ورق الترشيح (Cellulose nitrate filter) ذو قطر (0.45µm ) وبعد إتمام عملية الترشيح تم وضع أوراق الترشيح على إطباق زرعيه بلاستيکية حاوية على الوسط ألزرعي PDA ثم حضنت الأطباق بالحاضنة عند درجة 30 م°.أما عينات الرواسب الطينية فقد زرعت بطريقة التخفيف حيث تم وزن 1جم من العينة ومن ثم وضعه في أنبوبة حاوية على ماء مقطر معقم 10 مل وبعد رج المحلول (التخفيف) جيدا تم أخذ 1مل ووضع في منتصف طبق زرعي معقم ومن ثم صب عليه مقدار من الوسط الزرعي PDA المبرد بدرجة 45م°وبعد تصلب الوسط الغذائى بالإطباق تم نقلهل الى الحاضنة عند درجة 30 م°.

فحص العينات وتشخيصها

فحصت الأطباق المذکورة أعلاه بعد 48 ساعة من التحضين لمشاهدة النمو الخميري , وأهملت الأطباق التي لا تحتوي على النمو الخميري بعد خمسة أيام (Brooks et.al., 2007 ). تم الفحص الأولي للأطباق باستخدام المجهر التشريحي  ثم فحصت الخمائر المعزولة تحت المجهر الضوئي وذلک بتحضير شرائح زجاجية نظيفة وضعت عليها قطرة من صبغة اللاکتوفينول ازرق قطن , ونقل جزء من المستعمرة الخميرية النامية إلى الشريحة الزجاجية بواسطة الإبرة المعقمة Sterile needle , ثم وضع غطاء الشريحة . شخصت الخمائر المعزولة خلال الدراسة الحالية بالاعتماد على المراجع الآتية : (McGinnis, 1980;  Ellis, 1994;  de Hoog & Guarro, 1995;  Sullivan & Coleman, 1998; Kurtzman & Fell, 1999).  وقد تم عد المستعمرات الخميرية بواسطة جهاز عد المستعمرات, ومن ثم نقلت العزلات على وسط زرعي مائل في قناني معقمة وأيضا نقلت في وسط زرعي سائل في قناني معقمة وأخيرا نقلت على وسط زرعي شبه صلب في قناني معقمة والکل تم حفظه بالثلاجة بعد إن نميت بالحاضنة لحين استخدامها لاستکمال التشخيص.

حساب نسبة التردد والظهور المکاني للخمائر المعزولة :

     حسبت النسبة المئوية للتردد والظهور للأنواع الخميرية المعزولة من مواقع الدراسة العشوائية وحسب المعادلات التالية وحسب ما ذکره (Muhsin, 1985

النسبة المئوية للتردد =                                                                                      ×100  

النسبة المئوية للظهور =                                                                                    ×100

جدول ( 1 ) أرقام وأسماء المواقع التى جمعت منها عينات المياه والرواسب من أنهر محافظة البصرة

التشخيص بواسطة جهاز فايتک:

تم تحضير الأنابيب الخاصة بالجهاز ووضعها في قالب خاص بالجهاز يدعى Cassete ملئت هذه الأنابيب بمقدار 3 مل من المحلول الملحي الخاص بالجهاز ومن ثم وضع فيها جزء من المستعمرات الخميرية المراد تشخيصها  على إن تکون بعمر 1-2 يوم وبعد نقل المستعمرات إلى داخل الأنابيب بواسطة الإبرة المعقمة تم رج الأنابيب جيدا بواسطة جهاز الهزاز ليتجانس العالق ومن ثم تم قياس کثافة العالق بواسطة قياس الکثافة أو العکرة على إن لا تتجاوز الحدود المقررة للجهاز وهي إن تکون الکثافة للخمائر بين 1.80 – 2.20 وبعد ذلک تم وضع الکارتات بداخل الأنابيب ومن ثم تم إدخال بيانات الرقم التسلسلي للکارت بواسطة جهاز Bar Code  المحمول تم توجيه أشعة ليزر نحو الرقم التسلسلي لکل کارت ويتم إدخاله في الحاسبة في قائمة خاصة لکل قالب الذي يتضمن عشر عزلات فقط للاختبار وبعد ذلک تم کتابة رقم لکل عزلة وتم حفظ البيانات ومن ثم إدخال القالب في باب تعبئة الکارت يدعى Filler والتى تکون مفرغة من الهواء ثم يتم غلق الباب وضغط على زر أبدا حيث تستمر العملية 70 ثانية يتم خلالها سحب السوائل من الأنابيب إلى داخل الکارتات, وعند الإنتهاء يؤشر داخل الشاشة بکلمة Complete ومن ثم نقل القالب إلى الباب الثاني يدعى Loader وغلق الباب وبعد ثلاث دقائق ونصف تکمل العمليات داخل هذا الباب حيث يقوم الجهاز بقطع حراري للأنبوب الشعري المتصل بکل کارت تدعى العملية (Sealing ), ومن ثم يقوم الجهاز برفع الکارتات لغرض العمل عليها داخل الجهاز تدعى العملية (Loading ), ومن ثم يؤشر بکلمة Remove  يطلب فتح الباب وإخراج القالب وبعد ذلک تحضن العينات داخل الجهاز إلى اليوم التالي حيث يتم إکمال النتائج وعرضها على شکل تقرير (Funke, et.al.,1998) . وقد أجرى هذا الإختبار في مختبر البکتريولوجي بمستشفى الصدر التعليمي / محافظة ميسان .

النتائج

1-       التشخيص باستخدام جهاز VITEK 2 COMPACT  

تم تشخيص جميع العزلات التي تبلغ 300 عزلة بواسطة تقنية جهاز  Vitek 2 compact وقد استخدم لغرض التشخيص بهذا الجهاز 15 کت خاصة لتشخيص الخمائر من نوع YST vitek 2 KIT (USA) وبينت النتائج أن هناک تنوعا حيويا لأنواع مختلفة من الخمائر سواء الکيسية (Ascomycetes) أو البازيدية (Basidiomycetes ). وقد أمکن عزل 15 نوعا تنتمى إلى 5 أجناس  من الخمائر کما هى موضحة بالجدولين (2, 3) منها 9 أنواع لجنس کانديدا (Candida) ونوعين لکل من کربتوکوکس (Cryptococcus) و رودوتورييولا (Rhodotorula) بالإضافة إلى نوع واحد من ستيفانوأسکس (Stephanoascus) ونوع لم يتم تعريفه يتبع جنس کلوکيرا (Kloeckera)

2-        عدد المستعمرات والظهور المکاني للخمائر المعزولة من الماء والرواسب  :-

اظهرت النتائج بالجدولين (2, 3) أن جميع الأنهار بمحافظة البصرة تحتوى على أنواع مختلفة من الخمائروأن العدد الکلى للمستعمرات يتراوح بين  6 مستعمرات فى العينة (13) بموقع المدينة  و 21 مستعمرة فى العينة (23) بالمعقل-1. وقد کان النوع Candida tropicalis هو الأکثر عددا (112 مستعمرة بنسبة 37,3% من اجمالى عدد المستعمرات) والأعلى ظهورا فى جميع الأنهار موضع الدراسة بنسبة 100% من المواقع. کما حقق کل منCandida glabrata, Cryptococcus laurentii  نسبة ظهور عالية بلغت 96% و 84%  على التوالى. أما کل من Candida famata, Cryptococcus albidus, Rhodotorula glutinis, Candida krusei  فکانت متوسطة الظهور فى أنهار محافظة البصرة ( 48%, 40%و 32% و 28% على التوالى). أما نوع Candida. lipolytica فقد سجل اقل نسبة  للظهور بين الأنواع المعزولة) 8%) کما هو موضح بالجدول رقم (3). 

المناقشــــــة

تعتبر الخمائر کائنات حية مجهرية تنتمى للفطريات معظمها أحادية الخلية غير متحرکة والتکاثر النموذجي لها هو التکاثر الخضري أو اللاجنسي بواسطة التبرعم . يعود سبب فصلها عن الفطريات الخيطية هو إن التعامل معها بالمختبر لأجل التشخيص يتم بطرق تشبه طرق تشخيص البکتريا وهي بحدود 90 اختبار تعود لتشخيص الصفات المظهرية والفسلجية والکيموحيوية والتراکيب الجنسية واللاجنسية للخمائر     ((Phaff et al.,1978; Arx, 1980. وتتوزع الخمائر ما بين الفطريات البازيدية والکيسية والناقصة (Barnett et al.,1990) .

وقد أثبتت نتائج الدراسة الحالية انتشار الخمائر في معظم الأنهر والرواسب لتلک الأنهر من مواقع مختلفة في محافظة البصرة / العراق وأيضا من المياه البحرية لتلک المحافظة وهذا دليل على قابلية الخمائر على النمو والتعايش في مختلف البيئات وباختلاف العوامل البيئية من ملوحة أو درجة حرارة أو دالة حامضية وغيرها وهذا ما اتفق مع دراسات لبعض الباحثين التي أثبتت بان الخمائر من الکائنات المجهرية التي تفضل الدالة الحامضية بحدود 5.5 وأيضا قد وجدت في الدالة الحامضية 2 ولکن لا تفضل الدالة القاعدية وقد وجد أيضا أنها لها القدرة  على إن تنمو في الترکيز الملحي  العالي لبعض البيئات (Phaff et al., 1978 ). وتفضل النمو في درجة حرارة تقع بين (15- 30 م°) سواء کان بالبيئة أو المختبر (Phaff and Starmer, 1987 ).

کما أن الخمائر لها القدرة على البقاء في کل مکان من النظام البيئي المائي والتربة إذ أنها کائنات ذات قدرة على التحمل الملحي للبيئة المائية على مدى واسع من الملوحة وکذلک درجة الحرارة ونسبة الاوکسيجين والدالة الحامضية (Boguslawska – Was and Dabrowski, 2001 ). لذلک فان الخمائر قد عزلت من البحيرات والرواسب البحرية (MacGillivray and Shiaris, 1993; Boguslawska – Was and Dabrowski, 2001 ).

إي أنها تتواجد في کل مستويات عمود الماء (Wurzbacher et al., 2010).

وقد أمکن عزلها من البحيرات الفقيرة فى محتواها من الغذاء العضوى Oligotrophic في Patagonia, Argentina (Brandao et al., 2011 ), وعزلت من البحيرات متوسطة الغذاء Mesotrophic في الولايات المتحدة (Van Uden and Ahearn , 1963), وأيضا عزلت من البحيرات التي تستقبل أو تستلم فضلات مختلفة المصدر (Meyers et al., 1970 ), وعزلت من البحيرات الترفيهية السياحية في البرازيل (Medeiros et al., 2008 ), وفي کل الحالات التي ذکرت من العزل للخمائر تعود إلى الأجناس التالية Candida, Rhodotorula, Cryptococcus وکل هذه الأجناس هي مرضية وان کانت موجودة بالبحيرات الملوثة بواسطة فعاليات الإنسان والحيوان أو من البحيرات الغير ملوثة تعتبر کدليل ببيولوجي على مستوى التلوث الذي يؤثر على کل نواحي الحياة من الکائنات المائية أو أيضا الإنسان والحيوان وحتى النبات وذلک لتعلق الکائنات الحية بالبيئة المائية (Hagler, 2006).

أکدت دراسة Hagler وجماعته (1995)  على تنوع الخمائر في النظام البيئي في البرازيل کما أوضحت دراسة  Silva – Bedoya وجماعته (2014مدى التنوع البيولوجي للخمائر في الرواسب الطينية والماء للبحيرات الاصطناعية في Colombian وهناک دراسات عديدة متفقة مع هذه الدراسة ومنها ( Nagahama et al.,2001; Urano et al., 2001; Kandasamy et al.,2012; Chen et al.,2009 ).

وفيما يتعلق باستخدام تقنية جهاز Vitek 2 compact system  في الدراسة الحالية فقد أکدت على مدى دقة وسرعة التشخيص بتلک التقنية التي تستخدم لتعريف العديد من الأحياء المجهرية منها الخمائر والبکتريا والفيروسات والطحالب الدقيقة والطفيليات وقد اتفق ذلک مع دراسة (Mondelli et al., 2012 ) التي أثبتت إن تقنية جهاز Vitek  - Biomerieux system (Durdam, USA)  هي تقنية سريعة ودقيقة يجب العمل بها في التشخيص المختبري للأحياء المجهرية وفي کل المختبرات الروتينية . وإما دراسة (Ligozzi et al., 2002 ) التي أثبتت تطور هذه التقنية بحيث يمکنها أيضا تشخيص المضاد لکل کائن مجهري ممرض بواسطة کارت للتشخيص .

جدول (2):عدد المستعمرات لکل نوع من الخمائر المعزولة من أنهار محافظة البصرة (25 نهرا) ومجموع العدد الکلى للأنواع بکل نهر(*). 

جدول (3):إجمالى عدد المستعمرات لکل نوع من الخمائر المعزولة والنسبة المئوية لها ( منسوبة لـ 300 مستعمرة) وعدد مرات الظهور (فى25 نهرا)

والنسبة المئوية لها.

المصادر

Arx, J. A. von.(1980). A Mycologists view of yeasts . In : SKINNER , PASSMORE & DAVENPORT (eds.), Biology and Activities of yeasts . London, Academic Press . 53-61p.

Balasubramanian M, Bi E, Glotzer M (2004). "Comparative analysis of cytokinesis in budding yeast, fission yeast and animal cells". Curr Biol 14 (18): R806–18. PMID 15380095.

Barnett, J.A.; Payne, R.W. and Yarrow, D. (1990). Yeasts : characteristics and identification . Cambridge Univ. Press . 1024p.

Boguslawska – Was E., and Dabrowski W.(2001). The seasonal variability of yeasts and yeast – like organisms in water and bottom sediment of the Szczecin Lagoon . int J. Hyg Environ. Heal. 203: 451-458.

Brandao, L.R.; Libkind, D.; Vaz, A.B.M.; Espirito Santo, L.C.; De Garcia, V.; Van Broock, M. and Rosa, C.A.(2011). Yeasts from an oligotrophic lake in Patagonia (Argentina) : diversity , distribution and synthesis of photoprotective compounds and extracellular enzymes . FEMS Microbiol. Ecol. 76: 1-13.

Brooks, G.F.; Carrol, K.C.; Butel, J.B. and Morse, S.A.(2007). Medical Microbiology 24th ed; 642-645p.

Chen, Y., Yanagida, F., and Yu- Chen, L.(2009). Isolation of marine yeasts from coastal waters of northwest Taiwan. Aquatic biology , Published online December 29. Vol. 8: 55-60.

Eills,D. H.1994. Clinical mycology : the human opportunistic mycosis Gillingham . Printers pty. Ltd. Australia. 166.

Funke, G.; Monnet, C.; De Bernardis, A. Von Graeventiz, and Freney, J.(1998). Evaluation of the VITEK 2 system for rapid identification of medically relevant  gram – negative rods . J. Clin. Microbiol . 36: 1948-1952.

Hagler, A.N., Mendonca –Hagler, L.C. and Morais, P.B.(1995). Yeasts as an example of microbial diversity in Brazilian Ecosystems . Vol. 1 : Estrutura , Funcionamento , e Manejo de Ecossistemas Brasileiros , Esteves , F.A.(editor), 1995. 225-244.

Hagler, A.N.(2006). Yeasts as indicators of environmental quality In: Gabor, P.; Rosa, C. (ed.). 2006. Biodiversity and Ecophysiology  of yeasts . Springer , Berlin. 515-532.

Hoog de, G. S. and Guarro, J. 1995. Atlas of clinical fungi . center albureau voor shimmel – cultures and universitat rovirari virgili. Spain 720.

Kandasamy, K., Alikuhhi, M.N., and Subramanian, M.(2012). Yeasts in marine and estuarine environments . Journal of yeast and fungal research Vol. 3(6), 74-82pp. ISSN 2141 2413©2012 Academic journal.

Kurtzman , C.P. and Fell, J.W.(1999). The Yeasts A Taxonomic Study. Fourth revised and England edition . ISBN: 0444 81312 8, 903P.

Ligozzi, M.; Bernini, C.; Bonora, G.M.; DeFatima, M.; Zuliani, J. and Roberta, F.(2002). Evaluation of the vitek 2 system for identification and antimicrobial susceptibility testing of medical relevant Gram – Positive Cocci. American society for Microbiology . J. Clinical Micro. 1681-1686.

MacGillivary, A.R. and Shiaris , M.P.(1993). Biotransformation of poly – cyclic aromatic hydrocarbons by yeasts isolated from coastal sediments . Appl. Environ. Micro. 59: 1613-1618.

Mc Ginnis, M. R. 1980. Laboratory handbook of medical mycology . Academic Press , New York, 387-390.

Medeiros , A.O.; Kohler, L. M. ; Hamdan, J. S.; Missagia, B. S. ; Barbosa, F.A.R. and Rosa, C.A.(2008). Diversity and antifungal susceptibility of yeasts from tropical freshwater  environments in Southeastern Brazil. Water Res. 42: 3921-3929.

Meyers, S.P.; Ahearn, D.G. and Cook , W.L.(1970). Mycological studies of lake Champlain . Mycologia. 62: 504-515p.

Mondelli, A.L.; Niero- Melo, L.; Bagagli, E.; Camargo, C.H.; Bruder- Nascimento, A.; Sugizaki, M.F.; Carniero, M.V. and Villas, B.P.(2012). Candida spp. : manual identification (reference method) and automated identification (vitek system platform). The journal of venomous animals and toxins including tropical diseases . ISSN 1678- 9199. VOL. 18. 335-339.

Muhsin, T.M. (1985). Studies of fungi associated with island salt marsh halophytes of delta marsh Canada. Ph. D. Thesis, University of Manitoda ,Canada. 318p.

Nagahama, T., Hamamoto, Makiko., Nakase , T., Takami1, H., and Horikoshi1, K.(2001). Distribution and identification of red yeasts in deep – sea environments around the northwest Pacific Ocean . Kluwer Academic publishers . Printed in the Netherlands . Antoine van Leeuwenhoek , 80: 101-110.

Phaff, H.J. ; Miranda, A. M. and Miller, M.W.(1978a). Pichia cactophila, a new species of yeast found in decaying tissues of cactus . Int. J. Syst. Bacteriol ., 28: 318-325.

Phaff, H.J. and Starmer , W.T.(1987). Yeasts associated with plants , insects and soils . In : ROSE, A. H. , HARRISON , J.S. (eds.). The yeasts . 2 ed . New York . Academic Press, Vol. 1 , 123-180p.

Silva – Bedoya, L.M.; Ramirez –Castrillon , M. and Osoiro- Cadavid , E.(2014). Yeasts diversity associated to sediments and water from two Colombian artificial lakes. Copyright 2014 , Sociedade Brasileira de Microbiologia . www.sbmicrobiologia.0rg.br. , Brazilian Journal of Microbiology 45,1, 135-142p.ISSN 1678-4405.

Sullivan, D. and Coleman, D. 1998. Candida dubliniensis : characteristics and identification . J. Clin. Microbial . 36: 329- 334.

Urano, N.; Yamazaki, M. and Ueno, R.(2001). Distribution of halotolerant and / or fermentative yeasts in aquatic environments . Journal of Tokyo Univ. of Fisheries , Vol. 87, 23-29pp.

Van Uden N., Ahearn D. G. (1963): Occurrence and population densities of yeast species in fresh-water lake. Antonie van Leeuwenhoek 29: 308 – 312.

Wurzbacher, C.M. ; Barlocher, F. and Grossart, H.P.(2010). Fungi in lake ecosystems . Aquat  Microb. Ecol. 59: 125-149.

عزل الخمائر من مياه أنهار مختلفة في محافظة البصرة وتشخيصها بتقنية جهاز فايتک

                                                                           Vitek 2 compact system 

   د. سناء قاسم بدر  و د. باسل عبد الزهرة عباس

الملخص العربي :

إستهدفت الدراسة الحالية عزل وتشخيص الخمائر المنتشرة فى مياه ورواسب خمسة وعشرين نهرا فى محافظة البصرة بالعراق وذلک فى الفترة من شهر نيسان 2014 إلى شهر شباط 2015. وقد أستخدم لعزل الخمائر الوسط المزرعى المکون من البطاطس والکسترور والأجار  (PDA) بعد ترشيح عينات المياه أو تخفيف الرواسب. وأمکن الحصول على 300 عزلة نقية من الخمائر تم تشخيصها بتقنية حديثة بإستخدام جهاز Vitek 2 Compact system بعد تحميل کروت التعريف بمعلق الخلايا الحية للخمائر. أسفرت النتائج عن عزل وتعريف 300 سلالة من الخمائر تم تصنيفها إلى 15 نوعا تنتمى إلى 5 أجناس هي: Candida, Cryptococcus, Kloeckera, Rhodotorula, Stephanoascus

وأظهرت النتائج أن نوع Candida tropicalis هو الأکثر ترددا بين الأنواع المعزولة وقد بلغت نسبة التردد 36.3 % وأما نوع Candida lipolytica فکان الأقل ترددا إذ سجل نسبة تردد بلغت 0.7 %.  وفيما يخص المواقع الغنية بالخمائر کان موقع المعقل -1 هو الأکثر ثراء إذ بلغ عدد المستعمرات 21  مستعمرة   بينما سجل موقع المدينة اقل عدد من هذه الخمائر (6 مستعمرات فقط).

الکلمات المفتاحية :- الخمائر- أنهار البصرة – کانديدا Vitek -2, Candida,   .

المقدمة

الخميرة هي کائنات مجهرية حقيقية النواة من مملکة الفطريات، وفيها نحو 1500 صنفا. ومعظمها يتکاثر لا جنسياً. يستعمل الإنسان الخميرة في الخبز وتصنيع المشروبات الکحولية.  تتکون الخميرة المُستخدمة تجاريًا من تجمعات من کائنات الخميرة المجهرية أحادية الخلية. وعلى الرغم من وجود أکثر من 600 نوع من الخمائر إلا أن القليل منها فقط له استخدامات تجارية.

کان الإنسان حتى عام 1876م يصنع الخبز والجعة والنبيذ بدون أن يتفهّم أو يعي الدور الذي تؤديه الخميرة في صناعة هذه المنتجات. وفي ذلک العام (1876م)، أفاد العالم الفرنسي لويس باستير أن الخميرة کائن حي وأنها تؤدي دورًا مهمًا في صناعة البيرة.

تتکاثر الخميرة بسرعة وتنمو بدرجة جيدة خاصة في البيئة المحتوية على سُکَّر. تتکاثر الخميرة بالانقسام (انقسام الخلية الواحدة إلى خليتين) أو بالتبرعم. وأثناء التبرعم ينتفخ جزء من جدار الخلية

ويُکوِّن نموًا جديدًا يُسمى البرعم. وينفصل هذا البرعم بعد ذلک ويکون خلية جديدة مستقلة.

تفتقر فطريات الخميرة إلى الکلوروفيل (مادة اليخضور)، وهي المادة الخضراء التي يستخدمها النبات لتکوين غذائه. لذلک، فإن الخميرة تعتمد على مصادر خارجية للحصول على الغذاء. تتغذى الخميرة بالسکر الناتج من المصادر الطبيعية المختلفة مثل الفاکهة والحبوب والعصائر والمولاس. تُنتِج خلايا الخميرة مرکبات کيميائية تُسمى إنزيمات، أو مخمرات، لها القدرة على تحليل غذاء الخميرة. تنتج أنواع مختلفة من الخمائر أنواعًا مختلفة من الإنزيمات. وبعض الإنزيمات تُکسِّر السکَّريات إلى کحول وغاز ثاني أکسيد الکربون أثناء عملية التخمر (Balasubramanian et al., 2004).

يعتبر جهاز VITEK 2 COMPACTSYSTEM والمدمجة - إنتاج شرکات بيوفارما مثاليا للتشخيص الروتيني للميکروبات حيث يضمن التميز وحسن تدفق العمل وهو مزود بقاعدة البيانات الخاصة به والتى تمکن VITEK® 2 من تشخيص مجموعة کبيرة من الکائنات الحية الدقيقة تتميز بالاتي :-

• ·  سير العمل الأمثل لجميع المراحل، من القراءة   لتسجيل النتائج

التتبع الکامل: يتم التقليل من مخاطر أخطاء النسخ تعتمد کفاءة نظام ضغط VITEK® 2 على التکنولوجيا المتقدمة لقياس الألوان حيث يقوم النظام بقراءة أحدث بطاقات اختبار الجيل VITEK والتى تحتوي على 64 بئرا لضمان الدقة - کل 15 دقيقة بإستخدام ثلاث موجات مختلفة مع هذه التقنية ويمکن تحليل المزيد من البيانات، مما يزيد من دقة النتائج.

المواد وطرق العمل :-

جمع العينات وزرعها :

جمعت خلال الدراسة 125 عينة ماء و125 عينة رواسب طينية وذلک من 25 نهرا فى مواقع مختلفة بمحافظة البصرة کما هو موضح بالجدول رقم (1) وکانت فترة الجمع من شهر نيسان 2014 لغاية شهر شباط 2015 بواقع خمس مکررات لکل نهر(ماء + رواسب طينية ), وکان الجمع فيما يخص عينات الماء بواسطة قناني زجاجية سعة 100 مل معقمة ويکون اخذ العينة على عمق 30 سم وأما عينات الرواسب الطينية فقد وضعت فى أکياس نايلون معقمة وتم اخذ العينة من جرف النهر من سطح التربة مرة ومن عمق 30 سم مرة أخرى .

تم زرع العينات حسب نوع العينة حيث تزرع العينات المائية بطريقة الترشيح وذلک بترشيح 50 مل من ماء العينة بواسطة ورق الترشيح (Cellulose nitrate filter) ذو قطر (0.45µm ) وبعد إتمام عملية الترشيح تم وضع أوراق الترشيح على إطباق زرعيه بلاستيکية حاوية على الوسط ألزرعي PDA ثم حضنت الأطباق بالحاضنة عند درجة 30 م°.أما عينات الرواسب الطينية فقد زرعت بطريقة التخفيف حيث تم وزن 1جم من العينة ومن ثم وضعه في أنبوبة حاوية على ماء مقطر معقم 10 مل وبعد رج المحلول (التخفيف) جيدا تم أخذ 1مل ووضع في منتصف طبق زرعي معقم ومن ثم صب عليه مقدار من الوسط الزرعي PDA المبرد بدرجة 45م°وبعد تصلب الوسط الغذائى بالإطباق تم نقلهل الى الحاضنة عند درجة 30 م°.

فحص العينات وتشخيصها

فحصت الأطباق المذکورة أعلاه بعد 48 ساعة من التحضين لمشاهدة النمو الخميري , وأهملت الأطباق التي لا تحتوي على النمو الخميري بعد خمسة أيام (Brooks et.al., 2007 ). تم الفحص الأولي للأطباق باستخدام المجهر التشريحي  ثم فحصت الخمائر المعزولة تحت المجهر الضوئي وذلک بتحضير شرائح زجاجية نظيفة وضعت عليها قطرة من صبغة اللاکتوفينول ازرق قطن , ونقل جزء من المستعمرة الخميرية النامية إلى الشريحة الزجاجية بواسطة الإبرة المعقمة Sterile needle , ثم وضع غطاء الشريحة . شخصت الخمائر المعزولة خلال الدراسة الحالية بالاعتماد على المراجع الآتية : (McGinnis, 1980;  Ellis, 1994;  de Hoog & Guarro, 1995;  Sullivan & Coleman, 1998; Kurtzman & Fell, 1999).  وقد تم عد المستعمرات الخميرية بواسطة جهاز عد المستعمرات, ومن ثم نقلت العزلات على وسط زرعي مائل في قناني معقمة وأيضا نقلت في وسط زرعي سائل في قناني معقمة وأخيرا نقلت على وسط زرعي شبه صلب في قناني معقمة والکل تم حفظه بالثلاجة بعد إن نميت بالحاضنة لحين استخدامها لاستکمال التشخيص.

حساب نسبة التردد والظهور المکاني للخمائر المعزولة :

     حسبت النسبة المئوية للتردد والظهور للأنواع الخميرية المعزولة من مواقع الدراسة العشوائية وحسب المعادلات التالية وحسب ما ذکره (Muhsin, 1985

النسبة المئوية للتردد =                                                                                      ×100  

النسبة المئوية للظهور =                                                                                    ×100

جدول ( 1 ) أرقام وأسماء المواقع التى جمعت منها عينات المياه والرواسب من أنهر محافظة البصرة

التشخيص بواسطة جهاز فايتک:

تم تحضير الأنابيب الخاصة بالجهاز ووضعها في قالب خاص بالجهاز يدعى Cassete ملئت هذه الأنابيب بمقدار 3 مل من المحلول الملحي الخاص بالجهاز ومن ثم وضع فيها جزء من المستعمرات الخميرية المراد تشخيصها  على إن تکون بعمر 1-2 يوم وبعد نقل المستعمرات إلى داخل الأنابيب بواسطة الإبرة المعقمة تم رج الأنابيب جيدا بواسطة جهاز الهزاز ليتجانس العالق ومن ثم تم قياس کثافة العالق بواسطة قياس الکثافة أو العکرة على إن لا تتجاوز الحدود المقررة للجهاز وهي إن تکون الکثافة للخمائر بين 1.80 – 2.20 وبعد ذلک تم وضع الکارتات بداخل الأنابيب ومن ثم تم إدخال بيانات الرقم التسلسلي للکارت بواسطة جهاز Bar Code  المحمول تم توجيه أشعة ليزر نحو الرقم التسلسلي لکل کارت ويتم إدخاله في الحاسبة في قائمة خاصة لکل قالب الذي يتضمن عشر عزلات فقط للاختبار وبعد ذلک تم کتابة رقم لکل عزلة وتم حفظ البيانات ومن ثم إدخال القالب في باب تعبئة الکارت يدعى Filler والتى تکون مفرغة من الهواء ثم يتم غلق الباب وضغط على زر أبدا حيث تستمر العملية 70 ثانية يتم خلالها سحب السوائل من الأنابيب إلى داخل الکارتات, وعند الإنتهاء يؤشر داخل الشاشة بکلمة Complete ومن ثم نقل القالب إلى الباب الثاني يدعى Loader وغلق الباب وبعد ثلاث دقائق ونصف تکمل العمليات داخل هذا الباب حيث يقوم الجهاز بقطع حراري للأنبوب الشعري المتصل بکل کارت تدعى العملية (Sealing ), ومن ثم يقوم الجهاز برفع الکارتات لغرض العمل عليها داخل الجهاز تدعى العملية (Loading ), ومن ثم يؤشر بکلمة Remove  يطلب فتح الباب وإخراج القالب وبعد ذلک تحضن العينات داخل الجهاز إلى اليوم التالي حيث يتم إکمال النتائج وعرضها على شکل تقرير (Funke, et.al.,1998) . وقد أجرى هذا الإختبار في مختبر البکتريولوجي بمستشفى الصدر التعليمي / محافظة ميسان .

النتائج

1-       التشخيص باستخدام جهاز VITEK 2 COMPACT  

تم تشخيص جميع العزلات التي تبلغ 300 عزلة بواسطة تقنية جهاز  Vitek 2 compact وقد استخدم لغرض التشخيص بهذا الجهاز 15 کت خاصة لتشخيص الخمائر من نوع YST vitek 2 KIT (USA) وبينت النتائج أن هناک تنوعا حيويا لأنواع مختلفة من الخمائر سواء الکيسية (Ascomycetes) أو البازيدية (Basidiomycetes ). وقد أمکن عزل 15 نوعا تنتمى إلى 5 أجناس  من الخمائر کما هى موضحة بالجدولين (2, 3) منها 9 أنواع لجنس کانديدا (Candida) ونوعين لکل من کربتوکوکس (Cryptococcus) و رودوتورييولا (Rhodotorula) بالإضافة إلى نوع واحد من ستيفانوأسکس (Stephanoascus) ونوع لم يتم تعريفه يتبع جنس کلوکيرا (Kloeckera)

2-        عدد المستعمرات والظهور المکاني للخمائر المعزولة من الماء والرواسب  :-

اظهرت النتائج بالجدولين (2, 3) أن جميع الأنهار بمحافظة البصرة تحتوى على أنواع مختلفة من الخمائروأن العدد الکلى للمستعمرات يتراوح بين  6 مستعمرات فى العينة (13) بموقع المدينة  و 21 مستعمرة فى العينة (23) بالمعقل-1. وقد کان النوع Candida tropicalis هو الأکثر عددا (112 مستعمرة بنسبة 37,3% من اجمالى عدد المستعمرات) والأعلى ظهورا فى جميع الأنهار موضع الدراسة بنسبة 100% من المواقع. کما حقق کل منCandida glabrata, Cryptococcus laurentii  نسبة ظهور عالية بلغت 96% و 84%  على التوالى. أما کل من Candida famata, Cryptococcus albidus, Rhodotorula glutinis, Candida krusei  فکانت متوسطة الظهور فى أنهار محافظة البصرة ( 48%, 40%و 32% و 28% على التوالى). أما نوع Candida. lipolytica فقد سجل اقل نسبة  للظهور بين الأنواع المعزولة) 8%) کما هو موضح بالجدول رقم (3). 

المناقشــــــة

تعتبر الخمائر کائنات حية مجهرية تنتمى للفطريات معظمها أحادية الخلية غير متحرکة والتکاثر النموذجي لها هو التکاثر الخضري أو اللاجنسي بواسطة التبرعم . يعود سبب فصلها عن الفطريات الخيطية هو إن التعامل معها بالمختبر لأجل التشخيص يتم بطرق تشبه طرق تشخيص البکتريا وهي بحدود 90 اختبار تعود لتشخيص الصفات المظهرية والفسلجية والکيموحيوية والتراکيب الجنسية واللاجنسية للخمائر     ((Phaff et al.,1978; Arx, 1980. وتتوزع الخمائر ما بين الفطريات البازيدية والکيسية والناقصة (Barnett et al.,1990) .

وقد أثبتت نتائج الدراسة الحالية انتشار الخمائر في معظم الأنهر والرواسب لتلک الأنهر من مواقع مختلفة في محافظة البصرة / العراق وأيضا من المياه البحرية لتلک المحافظة وهذا دليل على قابلية الخمائر على النمو والتعايش في مختلف البيئات وباختلاف العوامل البيئية من ملوحة أو درجة حرارة أو دالة حامضية وغيرها وهذا ما اتفق مع دراسات لبعض الباحثين التي أثبتت بان الخمائر من الکائنات المجهرية التي تفضل الدالة الحامضية بحدود 5.5 وأيضا قد وجدت في الدالة الحامضية 2 ولکن لا تفضل الدالة القاعدية وقد وجد أيضا أنها لها القدرة  على إن تنمو في الترکيز الملحي  العالي لبعض البيئات (Phaff et al., 1978 ). وتفضل النمو في درجة حرارة تقع بين (15- 30 م°) سواء کان بالبيئة أو المختبر (Phaff and Starmer, 1987 ).

کما أن الخمائر لها القدرة على البقاء في کل مکان من النظام البيئي المائي والتربة إذ أنها کائنات ذات قدرة على التحمل الملحي للبيئة المائية على مدى واسع من الملوحة وکذلک درجة الحرارة ونسبة الاوکسيجين والدالة الحامضية (Boguslawska – Was and Dabrowski, 2001 ). لذلک فان الخمائر قد عزلت من البحيرات والرواسب البحرية (MacGillivray and Shiaris, 1993; Boguslawska – Was and Dabrowski, 2001 ).

إي أنها تتواجد في کل مستويات عمود الماء (Wurzbacher et al., 2010).

وقد أمکن عزلها من البحيرات الفقيرة فى محتواها من الغذاء العضوى Oligotrophic في Patagonia, Argentina (Brandao et al., 2011 ), وعزلت من البحيرات متوسطة الغذاء Mesotrophic في الولايات المتحدة (Van Uden and Ahearn , 1963), وأيضا عزلت من البحيرات التي تستقبل أو تستلم فضلات مختلفة المصدر (Meyers et al., 1970 ), وعزلت من البحيرات الترفيهية السياحية في البرازيل (Medeiros et al., 2008 ), وفي کل الحالات التي ذکرت من العزل للخمائر تعود إلى الأجناس التالية Candida, Rhodotorula, Cryptococcus وکل هذه الأجناس هي مرضية وان کانت موجودة بالبحيرات الملوثة بواسطة فعاليات الإنسان والحيوان أو من البحيرات الغير ملوثة تعتبر کدليل ببيولوجي على مستوى التلوث الذي يؤثر على کل نواحي الحياة من الکائنات المائية أو أيضا الإنسان والحيوان وحتى النبات وذلک لتعلق الکائنات الحية بالبيئة المائية (Hagler, 2006).

أکدت دراسة Hagler وجماعته (1995)  على تنوع الخمائر في النظام البيئي في البرازيل کما أوضحت دراسة  Silva – Bedoya وجماعته (2014مدى التنوع البيولوجي للخمائر في الرواسب الطينية والماء للبحيرات الاصطناعية في Colombian وهناک دراسات عديدة متفقة مع هذه الدراسة ومنها ( Nagahama et al.,2001; Urano et al., 2001; Kandasamy et al.,2012; Chen et al.,2009 ).

وفيما يتعلق باستخدام تقنية جهاز Vitek 2 compact system  في الدراسة الحالية فقد أکدت على مدى دقة وسرعة التشخيص بتلک التقنية التي تستخدم لتعريف العديد من الأحياء المجهرية منها الخمائر والبکتريا والفيروسات والطحالب الدقيقة والطفيليات وقد اتفق ذلک مع دراسة (Mondelli et al., 2012 ) التي أثبتت إن تقنية جهاز Vitek  - Biomerieux system (Durdam, USA)  هي تقنية سريعة ودقيقة يجب العمل بها في التشخيص المختبري للأحياء المجهرية وفي کل المختبرات الروتينية . وإما دراسة (Ligozzi et al., 2002 ) التي أثبتت تطور هذه التقنية بحيث يمکنها أيضا تشخيص المضاد لکل کائن مجهري ممرض بواسطة کارت للتشخيص .

جدول (2):عدد المستعمرات لکل نوع من الخمائر المعزولة من أنهار محافظة البصرة (25 نهرا) ومجموع العدد الکلى للأنواع بکل نهر(*). 

جدول (3):إجمالى عدد المستعمرات لکل نوع من الخمائر المعزولة والنسبة المئوية لها ( منسوبة لـ 300 مستعمرة) وعدد مرات الظهور (فى25 نهرا)

والنسبة المئوية لها.

المصادر

Arx, J. A. von.(1980). A Mycologists view of yeasts . In : SKINNER , PASSMORE & DAVENPORT (eds.), Biology and Activities of yeasts . London, Academic Press . 53-61p.

Balasubramanian M, Bi E, Glotzer M (2004). "Comparative analysis of cytokinesis in budding yeast, fission yeast and animal cells". Curr Biol 14 (18): R806–18. PMID 15380095.

Barnett, J.A.; Payne, R.W. and Yarrow, D. (1990). Yeasts : characteristics and identification . Cambridge Univ. Press . 1024p.

Boguslawska – Was E., and Dabrowski W.(2001). The seasonal variability of yeasts and yeast – like organisms in water and bottom sediment of the Szczecin Lagoon . int J. Hyg Environ. Heal. 203: 451-458.

Brandao, L.R.; Libkind, D.; Vaz, A.B.M.; Espirito Santo, L.C.; De Garcia, V.; Van Broock, M. and Rosa, C.A.(2011). Yeasts from an oligotrophic lake in Patagonia (Argentina) : diversity , distribution and synthesis of photoprotective compounds and extracellular enzymes . FEMS Microbiol. Ecol. 76: 1-13.

Brooks, G.F.; Carrol, K.C.; Butel, J.B. and Morse, S.A.(2007). Medical Microbiology 24th ed; 642-645p.

Chen, Y., Yanagida, F., and Yu- Chen, L.(2009). Isolation of marine yeasts from coastal waters of northwest Taiwan. Aquatic biology , Published online December 29. Vol. 8: 55-60.

Eills,D. H.1994. Clinical mycology : the human opportunistic mycosis Gillingham . Printers pty. Ltd. Australia. 166.

Funke, G.; Monnet, C.; De Bernardis, A. Von Graeventiz, and Freney, J.(1998). Evaluation of the VITEK 2 system for rapid identification of medically relevant  gram – negative rods . J. Clin. Microbiol . 36: 1948-1952.

Hagler, A.N., Mendonca –Hagler, L.C. and Morais, P.B.(1995). Yeasts as an example of microbial diversity in Brazilian Ecosystems . Vol. 1 : Estrutura , Funcionamento , e Manejo de Ecossistemas Brasileiros , Esteves , F.A.(editor), 1995. 225-244.

Hagler, A.N.(2006). Yeasts as indicators of environmental quality In: Gabor, P.; Rosa, C. (ed.). 2006. Biodiversity and Ecophysiology  of yeasts . Springer , Berlin. 515-532.

Hoog de, G. S. and Guarro, J. 1995. Atlas of clinical fungi . center albureau voor shimmel – cultures and universitat rovirari virgili. Spain 720.

Kandasamy, K., Alikuhhi, M.N., and Subramanian, M.(2012). Yeasts in marine and estuarine environments . Journal of yeast and fungal research Vol. 3(6), 74-82pp. ISSN 2141 2413©2012 Academic journal.

Kurtzman , C.P. and Fell, J.W.(1999). The Yeasts A Taxonomic Study. Fourth revised and England edition . ISBN: 0444 81312 8, 903P.

Ligozzi, M.; Bernini, C.; Bonora, G.M.; DeFatima, M.; Zuliani, J. and Roberta, F.(2002). Evaluation of the vitek 2 system for identification and antimicrobial susceptibility testing of medical relevant Gram – Positive Cocci. American society for Microbiology . J. Clinical Micro. 1681-1686.

MacGillivary, A.R. and Shiaris , M.P.(1993). Biotransformation of poly – cyclic aromatic hydrocarbons by yeasts isolated from coastal sediments . Appl. Environ. Micro. 59: 1613-1618.

Mc Ginnis, M. R. 1980. Laboratory handbook of medical mycology . Academic Press , New York, 387-390.

Medeiros , A.O.; Kohler, L. M. ; Hamdan, J. S.; Missagia, B. S. ; Barbosa, F.A.R. and Rosa, C.A.(2008). Diversity and antifungal susceptibility of yeasts from tropical freshwater  environments in Southeastern Brazil. Water Res. 42: 3921-3929.

Meyers, S.P.; Ahearn, D.G. and Cook , W.L.(1970). Mycological studies of lake Champlain . Mycologia. 62: 504-515p.

Mondelli, A.L.; Niero- Melo, L.; Bagagli, E.; Camargo, C.H.; Bruder- Nascimento, A.; Sugizaki, M.F.; Carniero, M.V. and Villas, B.P.(2012). Candida spp. : manual identification (reference method) and automated identification (vitek system platform). The journal of venomous animals and toxins including tropical diseases . ISSN 1678- 9199. VOL. 18. 335-339.

Muhsin, T.M. (1985). Studies of fungi associated with island salt marsh halophytes of delta marsh Canada. Ph. D. Thesis, University of Manitoda ,Canada. 318p.

Nagahama, T., Hamamoto, Makiko., Nakase , T., Takami1, H., and Horikoshi1, K.(2001). Distribution and identification of red yeasts in deep – sea environments around the northwest Pacific Ocean . Kluwer Academic publishers . Printed in the Netherlands . Antoine van Leeuwenhoek , 80: 101-110.

Phaff, H.J. ; Miranda, A. M. and Miller, M.W.(1978a). Pichia cactophila, a new species of yeast found in decaying tissues of cactus . Int. J. Syst. Bacteriol ., 28: 318-325.

Phaff, H.J. and Starmer , W.T.(1987). Yeasts associated with plants , insects and soils . In : ROSE, A. H. , HARRISON , J.S. (eds.). The yeasts . 2 ed . New York . Academic Press, Vol. 1 , 123-180p.

Silva – Bedoya, L.M.; Ramirez –Castrillon , M. and Osoiro- Cadavid , E.(2014). Yeasts diversity associated to sediments and water from two Colombian artificial lakes. Copyright 2014 , Sociedade Brasileira de Microbiologia . www.sbmicrobiologia.0rg.br. , Brazilian Journal of Microbiology 45,1, 135-142p.ISSN 1678-4405.

Sullivan, D. and Coleman, D. 1998. Candida dubliniensis : characteristics and identification . J. Clin. Microbial . 36: 329- 334.

Urano, N.; Yamazaki, M. and Ueno, R.(2001). Distribution of halotolerant and / or fermentative yeasts in aquatic environments . Journal of Tokyo Univ. of Fisheries , Vol. 87, 23-29pp.

Van Uden N., Ahearn D. G. (1963): Occurrence and population densities of yeast species in fresh-water lake. Antonie van Leeuwenhoek 29: 308 – 312.

Wurzbacher, C.M. ; Barlocher, F. and Grossart, H.P.(2010). Fungi in lake ecosystems . Aquat  Microb. Ecol. 59: 125-149.