DETECTION OF Q FEVER IN HUMAN BY POLYMERASE CHAIN REACTION TEST (PCR)

DETECTION OF Q FEVER IN HUMAN BY POLYMERASE CHAIN REACTION TEST (PCR)

 

V.M. MAHER ALHOURANI^* A.A.EL-MONLA^** and HIAAM BSHARA^***

^*MSC. Vet. Med. (D.V.M) in Veterinary Science, Buplic Health and preventive Medicine-Faculty of Veterinary Medicine, AL-Baath University.

^** Professor of  Vet. Hgg. and Zoonoses, Faculty of Veterinary Medicine, AL-Baath University.

^***Associated  Prof. Dr.  in Microbiology and immunity- Faculty of medicine, AL-Baath University

Email: drma97@yahoo.com

 

	ABSTRACT
Received at: 7/8/2014     Accepted: 16/11/2014	Q fever is a rickettsial disease caused by Coxiella burnetii bacterium, This study was performed to investigate the existence of Q fever in human in the middle region of the Syrian Arab Republic, the study concentrated on two regions which are Hamah city and Mysiaf, in addition to some places between them, using PCR test. Coxiella burnetii had been detected as a causative agent of Q fever with consideration that the samples were taken randomly. The prevalence rate reached at (68%) of the human groups included in the study. This result requires High degrees of caution in order to control this disease.
Keywords: Q fever, PCR test human, Zoonosis.

 

الکشف عن الحمّى المجهولة (Q Fever)عند الإنسان باستخدام اختبار تفاعل سلسلة البوليميراز (PCR)

 

ماهر يوسف الحوراني ،عبد الله المنلا، هيام البشارة

 

Email: drma97@yahoo.com

 

 الحمى المجهولة عبارة عن مرض جرثومي تسببه جراثيم الکوکسيلّة البورنيتيّة , أجريت هذه الدراسة للتقصي عن وجود مرض الحمى المجهولة عند البشر في المنطقة الوسطى من القطر العربي السوري حيث ترکزت الدراسة على منطقة حماه ومصياف والمناطق الواقعة بينهما وباستخدام اختبار pcr فقد تم الکشف عن وجود الکوکسيلّة البورنيتيّة العامل المسبّب لمرض الحمّى المجهولة علماً أن العينات کانت عشوائية , وقد بلغت نسبة الانتشار (68%) من المجموعة البشريّة التي شملتها الدراسة. هذه النتائج تثبت وتوثّق بالدليل وجود مسبب المرض (الکوکسيلّة البورنيتيّة) عند البشر الموجودين في منطقة الدراسة الأمر الذي يستدعي أخذ الحيطة والحذر الشديدين لأجل التحکم بهذا المرض.

 

INTRODUCTION

المقدمـة

 

شهدت العقود الأخيرة ازدياد أهميّة الأمراض الحيوانيّة المصدر أو الأمراض المشترکة (Zoonosis) والتي يشترک في المعاناة من ويلاتها الناس والحيوانات معاً, إلى جانب ازدياد وتعقيد وسائل المواصلات, وهو أمرُ أدى في مقابل ذلک إلى تسهيل وتسريع نشر العوامل الناقلة للأمراض, حيث لم يعد بمقدور أي فرد أو جماعة أن يکون بمأمن من الإصابة, ورغم قطع خطوات کبيرة على درب التقدّم العلمي والتکنولوجي في تشخيص وتصنيف هذه الأمراض , ورغم الإنجازات الکبيرة التي تحققت في مضمار المعالجة والوقاية فإنّ هذه الأمراض لا تزال تشکّل تهديداً خطيراً للصّحة العامة في العالم. جاءت هذه المقالة للکشف عن أحد الأمراض المشترکة التي لم يسبق أن تمت دراستها بشکل جدّي في القطر من قبل , والتي تؤثّر على الصحّة الإنجابيّة وعلى الصحّة العامّة عند الإنسان والحيوان وهذا المرض هو مرض الحمّى المجهولة (حمّى کيو).

 

الحمّى المجهولة أو حمى کيو (Q fever) هو مرض مشترک يتميز عند الإنسان بالعديد من الأعراض أکثرها شيوعاً الأعراض الشبيهة بالإنفلونزا مع درجات متفاوتة من التهاب الرئة والتهاب الکبد، بينما يبدو التهاب شغاف القلب  (Endocarditis)العرض الرئيسي المميز للشکل المزمن للمرض (Parker et al., 2006). ترتکز أهميّة وخطورة الإصابة بالحمّى المجهولة عند المجترّات الصغيرة على حقيقة أنها من أکثر الحيوانات الحساسة للمرض, إضافة إلى  کثرة اختلاط الإنسان مع هذه الحيوانات واستهلاکه لمنتجاتها (Blasco,1998) , وبحسب مرکز الأمن الغذائي والصحّة العامة وهو معهد دولي للتعاون في مجال البيولوجيا الحيوانية فإن حمّى کيو هو مرض مشترک شديد العدوى (Highly contagious zoonotic disease) ينتج عن العامل الممرض داخل الخلوي والذي يدعى الکوکسيلّة البورنيتّة (Coxiella burnetii) وعلى الرغم من أن هذه العدوى تمّ وصفها لأوّل مرّة في العام 1930م إلّا أنها لا تزال مفهومة بشکل قليل (Center of food security and public health studies, 2007). وبحسب منظمّة الصحّة الحيوانيّة العالمية (OIE, 2012) فإن الحمّى المجهولة هو مرض منتشر في کل أنحاء العالم عدا نيوزيلندة , وعلى الرغم من أن المرض يوجد فعليّاً في کل المملکة الحيوانيّة ‘animal kingdoms’ بما فيها مفصليّات الأرجل فإنّه يظهر في الغالب على الإنسان والأبقار والأغنام والماعز (Lang, 1990; Maurin and Raoult, 1999; Arricau-Bouvery and Rodolakis, 2005 and Anette-Bøtner et al., 2010).

 

يسبّب هذه المرض جراثيم الکوکسيلّة البورنيتيّة وهي جراثيم متطفلة مجبرة داخل الخلية الحية، سلبية الغرام، ويمکن تلوينها بصبغة جيمسا ، يتراوح حجمها ما بين (0.2-0.4×0.4-1.0) ميکرون , وتعيش داخل الخلايا البلعمية للعائل المضيف، وتعتبر شديدة المقاومة للظروف البيئية الخارجية حين تواجدها خارج الخلية الحية (Dupuis,1985). تنتمي هذه الجراثيم لجنس (Legionellales) وعائلة (Coxiellaceae) (Voth and Heinzen , 2007) , وتعد العامل المسبب لمرض حمى کيو أو ما يسمى بمرض الحمى المجهولة ، حيث تم تشخيص هذا المرض لأول مرة عام 1935م  أثناء ظهـــور إصــابات عند عمال مسلخ  بريزوان في أستراليا (Hilbink, et al., 1993).

 

تتوفر لدى مختبرات قليلة الإمکانات والمعدات اللازمة للاستخلاص المأمون للکوکسيلة البورتينية، ولذلک يفضل الاعتماد على الاختبارات المصلية. إن تشخيص الحمى المجهولة عند المجترات بما فيه التشخيص التفريقي عن الأمراض المجهضة المماثلة تمّ بناءً على الاستفادة من الکشف بالميکروسکوب المتطوّر على عيّنات سريريّة بالترافق مع نتائج مسوحات مصليّة إيجابيّة (Lang, 1990) , وأمّا في الوقت الحالي فإن الکشف المباشر والقياس الذي يتم بواسطة اختبار(PCR) واختبار المقايسة المناعيّة الأنزيميّة ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) ينبغي أن يعتبر طرقاً مختارة للتشخيص السريري (Sidi-Boumedine et al., 2010) , کما أن اختبارات المقايسة المناعية المرتبط بالأنزيم ELISA , وتثبيت المتتمة تعد من الاختبارات المستخدمة بشکل روتيني (Maurin and Raoult, 1999). وقد استخدمت الطرق المختلفة لاختبار PCR بنجاح للکشف عن ال DNA الخاص بالکوکسيّلة البورنيتية في المزارع الخلوية والعيّنات البيولوجيّة, وعادة تستخدم هذه الطريقة للتقصّي الصحّي في قطعان المجترات حديثة الولادة والتي تحصل فيها حالات إجهاض (Sidi-Boumedine et al., 2010) , وتبدي الکوکسيلة البورنيتية مقاومة واضحة لمختلف العوامل الفيزيائية والکيميائية بسبب شکلها الشبيه بالبوغة , فهي تقاوم درجة الحرارة 60 درجة مئوية لمدة ستين دقيقة وتقاوم التعرض لترکيز (0,5 %) من الفورمالين لمدة أربعة أيام , ويمکنها أن تبقى حية في التربة والحليب لعدة أشهر (Maurin and Raoult, 1999) , وأمّا في المزارع الخلوية أو أجنة البيض المخصب فإن الکوکسيلة البورنيتية تبدي تغيراً في المظهر مرتبطاً بحدوث شطب صبغي (Genetic blot) يقود إلى  تبدل عديد سکريات شحمي , ومع الطور الأول عالي الفوعة يتغير المظهر إلى الطور الثاني غير المفوع , وتبدي العزولات المأخوذة من مناطق مختلفة في العالم درجة منخفضة من التغايرية الجينية (Maurin and Raoult,1999, Raoult, 2001).

 

بالنسبة لانتشار الحمّى المجهولة فهو واسع جدّاً بسبب ظاهرة الانتشــار عبر حمــل الريــاح (Windborne spread) (Boschini, et al., 1999 ) ولکن بحسب خرائط منظمّة الصحّة الحيوانيّة العالمية للعام 2013 فقد تبين أن المرض موجود في فلسطين المحتلّة وجزيرة قبرص وتم تشخيصه سريريّاً (OIE, 2012) , وهناک أبحاث موثّقة عن کشف الحمّى المجهولة في منطقة مرمرة الترکية, کما أنّ المرض موجود ومشخّص في بلغاريا واسبانيا واستراليا وأمريکا الشمالية وغيرها الکثير من بلدان العالم  (OIE, 2012) , ولکن لا يوجد حتّى اللحظة معلومات دقيقة عن انتشار المرض في سوريا عدا دراسة واحدة عند الأغنام (العمر, 2011).

 

العلامات السريرية عند الإنسان Clinical Signs In Human:

يمکن أن يکون مرض الحمى المجهولة حاداً أو مزمناً , والنتائج طويلة الأمد يتم التعود عليها کفصل ثالث للمرض , والعدوى اللاعرضية تعتبر شائعة ففي جائحة حصلت في أحد الوديان السويسرية تبين أن 50% من الأشخاص اللّذين تم التأکّد من إصابتهم مصلياً أصبحوا مرضى بشکل واضح (Dupuis et al., 1987).

 

1-  المرض الحاد Acute disease

يبدو الشکل الحاد لحمى کيو مشابهاً لأمراض الأنفلونزا مع درجات متفاوتة من التهاب الرئة والتهاب الکبد, وغالباً ما يحصل الخطأ في التشخيص نظراً لأن الأعراض متنوّعة وهي غير محددة بدقة (McQuiston and Childs, 2002) and (Fournier et al., 1998) , (Raoult,1996). الحمى ليست موجودة دائماً (Levy et al.,1999) , (Tissot-Dupont et al.,1992) کما أن إجراء التشخيص صعب, معدل الوفاة في هذه الحالة هو 1-2% (Tissot-Dupont et al.,1992) (Kermode et al., 2003). يعد التهاب عضلة القلب نادراً (<1%), لکنه واحد من أکثر الأسباب المؤدية للوفاة (Fournier et al., 2001).

 

 کان قد اشتمل وصف الباحث ديريک الأصلي للمرض على الحمى وألم شديد بالرأس أغلبه يقع خلف العينين, وتعرق غزير وأوجاع عضلية ومفصلية بالإضافة لفقدان الشهية وخسارة حادة للوزن (Derrick, 1937) , هذه السلسلة المتلاحقة تحصل في 5-20% من الحالات (De Alarcon et al., 2003)  and(Tissot-Dupont et al.,1992) , وفي (138) حالة کانت الأجسام المضادة للمرض موجودة حيث دامت الحمى بين 5-57 يوم بمتوسط عشرة أيام (Derrick,1973), وکانت معدلات الدخول للمشفى 5% لکنها کانت عبارة عن حالات عرضية بنسبة 63% (10 من أصل 16) (Carrieri et al., 2002). بالإضافة إلى عوارض شبيهة بالأنفلونزا يظهر التهاب الرئة الناتج عن حمى کيو بصورة سعال مخاطي غالباً مترافق مع ألم بالجنب والصدر (Marrie, 2003), وتکون التغيرات الظاهرة بالصورة الشعاعية للصدر غير محددة حيث يکون التهاب الرئة معتدل غالباً (Marrie, 2003) , ويعد التهاب الکبد الصريح المترافق مع اليرقان نادراً (Maurin and Raoult, 1999) , ولکن تضخم الکبد وارتفاع مقياس أنزيمات الکبد هي أمر شائع. دراسة أجريت على مجموعة من مرضى أحد المشافي في أستراليا تبين أنه فقط مريض واحد من أصل 111 مريضاً قد أصيب باليرقان , ولکن 51% من المرضى کان لديهم ضخامة بالکبد و 85% من هؤلاء المختبرين کلن لديهم نتائج اختبارات وظائف کبد غير طبيعية (Carrieri et al., 2002) , ويتراوح دور الحضانة من أسبوعين إلى  39يومًا بمتوسط 20 يوما للمرض, وخلافًا لأمراض الريکتسيات الأخرى لا تسبب حمى کيو طفحًا جلديًا. يتراوح المرض في الشدة لکن يکون حميدًا في معظم الحالات حيث تکون الکثير من حالات العدوى البشرية خفيفة وغير ظاهرة ولذلک تمر دون أن تکتشف, ونادرًا ما تهاجم حمّى کيو الأطفال تحت 10 سنوات ,مع ذلک تم التبليغ عن 18 حالة عند أطفال تحت عمر 3 سنوات خلال فترة 16 شهرًا في هولندا (Richardus et al., 1985) يکون المرض أکثر خطورة عند البالغين فــوق 40 سنة ومعدل إماتــة الحالات في حمى کيــو الحــادة أقل من1% (Raoult et al., 2000).

 

2- المرض المزمن chronic disease

 يشکل التهاب شغاف القلب (60-70%) من أعراض مرض حمى کيو بالشکل المزمن (Raoult D and Marrie, 1995), وتبين أنه في مرسيليا بفرنسا فإن 15% من حالات التهاب شغاف القلب ناتجة عن الکوکسيلّة البورنيتيّة (Marrie and Raoult, 1997) وتکون الحمى غائبة غالباً والنوابت الجرثومية (Vegetations) غائبة غالباً أو صغيرة (Marrie and Raoult, 1997),(Lepidi et al., 2003).

 

هناک ما معدله 12 شهر بين بداية المرض وتشخيصه (Marrie and Raoult, 1997). کل المرضى الّلذين ظهرت لديهم نتائج زرع سلبية لالتهاب شغاف القلب تم استثناؤهم من الإصابة بحمى کيو (Fournier et al., 1998), ويعد التهاب شغاف القلب قاتلاً ما لم يتم استخدام المعالجة بالمضادات الحيوية (Rolain et al., 2003) حيث يتطور التهاب شغاف القلب عادة عند الأشخاص الواقعين تحت تأثير المرض , ففي دراسة من 102 مريضاً فرنسياً 95 منهم کان لديهم اعتلالات صمامية موجودة مسبقاً وجد أنّ خمسة منهم کان لديهم مرض کابت للمناعة واثنان فقط لم يکن لديهما أي شيء مما سبق (Fenollar et al., 2001) , وعلى الرغم من أنّ مرض نقص المناعة المکتسب (الإيدز) غير مرتبط بالتهاب شغاف القلب لکنه مرتبط بحصول معدل أعلى للمرض الحاد عند الأفراد المعرضين للکوکسيلّة  البورنيتية (Boschini et al., 1999) , ومن الممکن أن يحدث المرض المزمن بعد شهر (Fenollar et al., 2001) أو سنوات من المرض الحاد ومن الممکن ألا يکون هناک تاريخ لمرض حاد (Wilson et al., 1976).

 

يصيب المرض الجهاز القلبي الوعائي بشکل رئيسي عندما يأخذ مساراً مزمنًا حيث يتراوح معدل الوفيّات للحالات في حمى کيو المزمنة من%65-%0 , في بريطانيا العظمى أصيب 92 (%11) من أصل839  حالة من حمى کيو المثبتة بالتهاب الشغاف و 10 بمرض کبدي (Palmer and Young, 1982), کما کان عند 259 مريضاً من 313 مصابًا بحمى کيو المزمنة التهاب الشغاف في دراسة في فرنسا ولدى معظمهم اعتلال صمامي سابق (Raoult et al., 2000). التهاب الشغاف هو المضاعفة الأکثر خطورة، وغالبًا ما يکون قاتلاً عندما يحدث بين البالغين مع تواتر أکثر في الذکور من الإناث, ويتطور التهاب الشغاف ببطء ويظهر عادة بعد 1- 20 سنة من المرض الحاد (Levy et al.,1999) , وقد لخّص الباحث ساويرز وزملاؤه (Sawyer et al., 1987) في العام (1987) مميزات 28 حالة من بلدان عديدة مختلفة حيث کان لدى % 89 من المرضى قصة لمرض صمامي، وکان الصمام الأبهري وحده هو الموقع في % 46 من الحالات ال 28 ، وکانت العلامات السريرية هي الحمى (86%) وضخامة الکبد (60%) وتضخم الطحال (68%) وبيلة دموية مجهرية (80%), وقدّرت إحدى الدراسات أن خطورة  تطور التهاب الشغاف هي  %39 بين المصابين بحمى کيو مع عيوب صمامية (Fenollar et al., 2001).

 

MATERIALS and METHODS

مواد وطرائق العمل

 

أولاً- مواد العمل: Materials

1- مجتمع الدراسة Study Population

تم البدء بالبحث من خلال القيام بعدة زيارات للمشفى الوطني بحماه ومصياف وللمجمّع الطبّي بحماه حيث تمّت مقابلة الأطبّاء المختصّين والمخبرييّن المسؤولين عن أخذ العيّنات, وتمّ أخذ الموافقة الرسميّة على أخذ العيّنات البشريّة المختلفة لأجل القيام بالکشف عن الکوکسيلّة البورنيتيّة فيها.

 

2- جمع البيانات: Collecting Data

تم الحصول على المعلومات المتعلقة بالاستبيان من خلال جمع البيانات ذات الصلة بموضوع الدراسة من قبل الباحثين , حيث تم تقسيم الاستبيان لعدة حقول أحدها تضمن معلومات عن المريض نفسه شملت الجنس والعمر إن وجد , وفيما إذا کان هناک إجهاض سابق أم لا عند النساء الحوامل , بينما الحقل الثاني شمل العينات من حيث نوعيّة العيّنة وتاريخ أخذ العينة والموقع, وأما الحقل الثالث فقد خصص لنتيجة اختبار ال PCR , وأما الحقل الأخير فهو للملاحظات, وقد شملت الدراسة 25 مريض ومريضة تم القيام بجمع البيانات المتعلقة بهم في الفترة الواقعة بين شهر شباط من العام 2013م وحتّى نهاية نيسان من العام 2013م. يبين الجدول رقم (1) صفيحة الاستبيان الوبائية التي تم تصميمها لجمع البيانات لمجتمع الدراسة خلال فترة الدراسة.

 

جدول رقم 1: ورقة استبيان للعيّنات المشمولة بالدراسة خلال الفترة الواقعة بين بداية شهر شباط من العام 2013م وحتّى نهاية نيسان من العام 2013م  في المنطقة الوسطى بسوريا.

 

 

ثانياً- طرائق العمل: Materials

1-       جمع العينات Collection of the samples

 قام الأطبّاء والمخبريّون بأخذ عيّنات على شکل مسحات مهبليّة من سيّدات تعرضن للإجهاض حاليّاً أو سابقاً ,کما تمّ القيام بأخذ عدّة مسحات بلعوميّة لأشخاص مصابين بالتهابات تنفسيّة معنّدة , وأخيراً تم أخذ عيّنات دم من قسم الأمراض الصدريّة والداخليّة بشکل عشوائي وتمّت معاملة هذه العيّنات لأجل استخلاص الکريّات البيضاء منها حيث سيتم لاحقاً اجراء اختبار (PCR) عليها.

 

1 - المسحات المهبلية Vaginal Swabs

جمعت مسحات مهبلية بغسل الفتحة الخارجية للمهبل وتطهيرها بمحلول اليود المائي (0.2%) وأدخلت المسحات المعقمة ودوّرت بشکل دائري داخل المهبل ونقلت إلى المختبر في حافظة مبردة (Alton et al., 1975).

 

2 - المسحات البلعوميّة pharynxal Swabs

 يتم إدخال المسحات المعقمة الى منطقة البلعوم ومسحها عدّة مرّات بشکل دائري , ومن ثم نقلها الى المخبر بحافظة مبّردة ليتم حفظها بالبرودة لحين الاستخلاص (Alton et al., 1975).

 

3 - عيّنات الدم Blood Samples

تم ّ أخذ عيّنات الدم من المرضى من قبل المخبريين المختصّين من وريد الساعد بعد تعقيم المنطقة بمحلول اليود المائي (0.2%) أو بالکحول الطبّي 70%, وتمّ وضع الدم في أنابيب تحتوي مضاد تخثّر (EDTA) , ثمّ تم نقلها بحافظات إلى المخبر بأسرع ما يمکن حيث تم بعدها العمل على استخلاص الکريّات البيضاء (نظراً لأن الکوکسيلّة البورنيتيّة تتوضع داخل الکريات البيضاء في جسم الثوي حيث تتکاثر ثم تفجّر الکريّة البيضاء لکي تهاجم خلايا أخرى) (Alton et al.,1988).

 

2-استخلاص الدناExtraction of DNA

1- استخلاص الدنا من المسحات Extraction of DNA from Swabs

تم الاعتماد على بروتوکول الاستخلاص المتّبع من قبل شرکة کياجن (Qiagen 2003) (QIAamp DNA Mini Kit and QIAamp DNA Blood Mini Kit Handbook-2003) , حسب المراحل التالية:

 

2-1-1- خطوات الاستخلاص:

 

1- توضع الماسحة بعد اخراجها من التجميد في أنبوب تثفيل سعة 2مل ونضيف 400ميکرو ليتر من محلول PBS (PH=8.3) ويراعى إخراج محتويات الماسحة إلى داخل الأنبوب عبر الضغط على ساق الماسحة باتجاه رأسها الموضوع داخل الأنبوب , وبعدها يتم فصل رأس الماسحة بالنسبة لماسحات القطن أو الديکرون بفصلها بواسطة اليد أو بمقص.

2 - يضاف 20ميکروليتر من محلول البروتياز (Qiagen Protease) أو من البروتياز  K, و400ميکرو ليتر من الدارئAL  للعيّنة. ويتم المزج حالاً بواسطة الرجّاج (Vortexing) لمدّة 15 ثانية.

3 - يتم التحضين بدرجة حرارة 56 درجة مئويّة لمدّة عشر دقائق , وبعدها نثفّل بسرعة عادية لفترة قصيرة لإزالة القطيرات من السطح الداخلي للغطاء.

4 - يضاف 400 ميکروليتر من الايتانول المطلق (96-100%) , ويجري المزج بالرج (Vortexing) , وبعدها نثفّل بسرعة عادية لفترة قصيرة لإزالة القطيرات من السطح الداخلي للغطاء.

5 - يتم نقل700ميکروليتر من المزيج في الخطوة رقم (4), الى عمود الفصل (Spin Column)(سعة 2مل) من دون ترطيب الغطاء , يغلق القلنسوة ويجري التثفيل على سرعة 6000g (8000د/دقيقة) لمدّة دقيقة واحدة , بعدها يتم وضع عمود الدوران في أنبوب جمع سعة 2مل نظيف ورمي الأنبوب الحاوي على الرشاحة.

6 - تعاد الخطوة السابقة رقم 5 کما هي.

7 - يتم فتح عمود الدوران بعناية ويضاف500ميکوليتر من الدارئ AW1 من دون ترطيب الغطاء, بعدها يتم إغلاق القلنسوة والتثفيل على سرعة 6000g (8000د/دقيقة) لمدّة دقيقة واحدة. بعد التثفيل يوضع عمود الدوران في أنبوب جمع نظيف سعة 2مل ويتم التخلّص من الأنبوب الحاوي على الرشاحة.

8 - يتم فتح عمود الدوران بعناية ويضاف 500ميکوليتر من الدارئ AW1 من دون ترطيب الغطاء , بعدها يتم إغلاق القلنسوة والتثفيل على سرعة قصوى 14000g (20000دورة/دقيقة) لمدّة 3 دقائق.

9 - يتم وضع عمود الدوران في أنبوب تثفيل صغري سعة 1.5 مل , ويتم التخلّص من أنبوب الجمع الحاوي على الرشاحة , يضاف لأنبوب التثفيل الصغري 150ميکرو ليتر من الدارئ  AE, أو الماء المقطّربعدها يجري التحضين بدرجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 دقيقة , يجري بعدها التثفيل عند 6000g (8000د/دقيقة) لمدّة دقيقة واحدة, وتحفظ المادّة بعد التثفيل الأخير برقم العيّنة الأساسي في البرّاد بدرجة حرارة (-20 د مئويّة) لحين الاستخدام.

 

2- استخلاص الدنا من الکريّات البيضاءExtraction of DNA from white cells

1-      يوضع 20ميکروليتر من البروتياز ک (Protease k)  في أنبوب اختبار نظيف سعة 2مل.

2-      يضاف للأنبوب أعلاه 200ميکروليتر من عيّنة الکريات البيضاء التي تم استخلاصها بطريقة الهيستوباک (إذا کانت الکميّة أقل من 200 تکمّل لهذا الحجم بمحلول الدارئة الملحيّة PBS ).

3-      يضاف 200 ميکروليتر من محلول دارئ AL إلى المزيج , ثم نرج الأنبوب بجهاز الفورتکس (Vortexing) لمدّة 15 ثانية.

4-      تحضين عند درجة حرارة 56د مئويّة لمدّة 10 دقائق بمحم مائي.

5-      تثفيل بطيء لإنزال القطرات العالقة على الغطاء الداخلي للأنبوب.

6-      يضاف 200 ميکروليتر من کحول الايتانول المطلق للمزيج ثم يتم الرج بالفورتکس , ومن ثمّ تثفيل بطيء لإنزال القطرات العالقة على الغطاء الداخلي للأنبوب.

7-      يتم بعدها نقل المحتويات الى عمود الفصل (Spin Column) (سعة 2مل) من دون ترطيب الغطاء, يغلق القلنسوة ويجري التثفيل على سرعة 6000g ( 8000د/دقيقة) لمدّة دقيقة واحدة (ينصح البعض هنا بأن يتم التثفيل بالسرعة القصوى حتّى تمام عمليّة التصفية بالفلتر الخاص بعمود الفصل).

8-      يتم التخلّص من الرشاحة ويوضع عمود الفصل على أنبوب تجميع جديد ويضاف بعد فتح الغطاء 500ميکروليتر من الدارئ AW1 وبعدها يتم التثفيل على سرعة 6000g (8000د/دقيقة) لمدّة دقيقة واحدة.

9-      يتم التخلّص من الرشاحة ويوضع عمود الفصل على أنبوب تجميع جديد ويضاف بعد فتح الغطاء 500ميکروليتر من الدارئ AW2 وبعدها يتم التثفيل على سرعة کاملة لمدّة 3دقائق للتأکّد من تمام التصفية بالفلتر.

10-  تنقل محتويات العمود إلى أنبوب أبندروف معقّم يضاف له 200ميکروليتر من الدارئة AE ثم يتم التحضين بدرجة حرارة الغرفة لمدّة 5 دقائق, ويتم بعدها إجراء تثفيل أخير يليه حفظ عيّنة الDNA في البرّاد عند درجة حرارة (-20 د مئويّة).

 

3-الاختبار الرسمي للکشف عن الکوکسيلّة البورنيتيّة:

Conventional PCR for detecting of Coxiella burnetii:

 (AccuPrime ® Taq DNA Polymerase)

 

1- عام General:

يتم تحديد الدنا الخاص بالکوکسيلّة البورنيتيّة من خلال مضاعفة الشدفة ذات الوزن (337pb) الموجودة في المورثة (IS1111) بين النيکليوتيد (349) والنيکليوتيد (685) وذلک باستخدام المشرّعات (البرايمرات) من النوع (Trans B and Trans M) , وذلک بحسب توصية المختبر الوطني الفرنسي للأبحاث الزراعيّة (laboratory INRA) (Institut National de la Recherche Agronomique) بالقسم المختص بالصحّة العامة والأمراض الحيوانيّة المعدية. يقدّم هذا النظام حساسيّة عالية للکشف عن السلالات الحقليّة الخاصّة بالکوکسيلّة البورنيتيّة , ولقد بنيت هذه الحساسيّة العالية على وجود نسخ متعدّدة من المورثة (IS1111) في DNA الکوکسيلّة البورنيتيّة من جهة , ومن ناحية أخرى على وجود مشرّعات أکثر فاعليّة من النوع (Trans B and Trans M) (Alsaleh et al., 2011).

 

2- المواد المستخدمة في اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسلPolymerase chain reaction  Materials

1-  المشرعات Primers: استخدمت مشرعات خاصة بجراثيم الکوکسيلّة البورنيتيّة والمنتجة في شرکة Funakoski اليابانية , سوائل المشرّع ذو التسلسل (5'-3 ' ) بترکيز 100 ميکرو مول , ومحفوظة بدرجة حرارة (- 20درجة مئويّة) (MWG - Eurofin). تحضير المحاليل الجاهزة : 20 ميکرومول في ماء معقّم خال من أنزيم ال RNase (distilled RNase-free water) بقسمة (1/5 أجزاء), وفيما يلي التسلسل النيکليوتيدي للمشرع من النمط B ومن النمط M:

 

▪ Trans B (349-371): CAA GAA TGA TAA CGA TCG TGC GC

▪ Trans M (664-685): CTC GTA ATC AAT ACC TTC CGC G

المصدر (Alsaleh et al., 2011)

 

2 - عتيدة اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل: Taq PCR Master mix 4x

-  والتي تحوي أنزيم البُوليميِراز(0,25 µl)Taq DNA Polymerase  (هو أنزيم يعود إلى مجموعة بوليميراز الدنا يستخرج من بکتريا المستحرة المائية (thermophilic bacterium) التي تعيش في درجات حرارة عالية مقارنة بأغلب البکتريا ويستخدم على نطاق واسع في التقنية الحيوية وهو إنزبم أساسي في تفاعل البوليميراز المتسلسل) (Alsaleh et al., 2011) , دارئة تفاعل البُوليميِراز المتسلسل مع کلور المَغْنيزيُوم (PCR Buffer with 3mM MgCl2) , والنيوکليوزيدات منقوصة الأوکسجين ثلاثية الفوسفات (μM dNTP200) (deoxynucleotide triphosphates), وهو مرکّز 10 مرّات  من شرکة Qiagen الألمانية.

 

3 - ماء مقطر خالي من DNAase:

ماء معقّم خال من أنزيم ال RNase (distilled RNase-free water),  استخدم في استخلاص قالب الدنا وفي تحضير مزيج التفاعل وقد تم الحصول عليه من شرکة Qiagen الألمانية.

 

4 - معلم الوزن الجزيئي (100bp DNA Molecular weight marker  )

تم الحصول عليه من شرکة (AB-gene) الإنجليزية والذي استخدم من أجل معرفة الوزن الجزيئي لنواتج التفاعل

 

5 - الأغاروزAgarose

تم الحصول عليه من شرکة (Peq lab) الألمانية واستخدم بترکيز 1.5% لغرض تحضير هلامة الأغاروز المستخدمة في الرحلان الکهربائي لنواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل.

 

6 - دارئة التحميل x Loading Buffer 10

تم الحصول عليها من شرکة TaKaRa اليابانية واستخدمت في حقن نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل عند إجراء الرحلان الکهربائي في هلامة الأغاروز.

 

7 - صبغة الإيثيديوم بروميد Ethidium Bromide

استخدمت الصبغة المصنعة في شرکة ميرک الألمانية والتي تتميز بأن لها القدرة على الارتباط بأنطقة الدنا الموجود في هلامة الأغاروز والتألق عند التعرض للأشعة فوق البنفسجية، وقد أضيفت إلى هلامة الأغاروز وإلى دارئة الرحلان بترکيز 1مکروغرام/مل.

 

3- اختبار PCR:

 

1- تجهيز مزيج الاختبار Preparation of the PCR Mix

يجري البدء بتحضير مزيج  PCR  في غرفة المزج حيث يتم المزج على حمالة أنابيب خاصّة وفي درجة حرارة منخفضة (قد تحتوي الحمالة على جليد). بعد الإذابة يتم مزج مواد التفاعل من خلال التدفّق الهادئ عبر الماصّة الدقيقة micropipette لبعض المواد مثل المشرّعات أو ال أنزيم (Taq polymeras) , أو يتم رج الدارئ. يتم بعدها القيام بدوران سريع لتجميع کل القطرات المتکاثفة في الأنبوب وبعدها تترک المواد في الجليد. ويلاحظ ما سبق في الجدول التالي (2):

 

الجدول 2: المواد الداخلة في اختبار PCR مع الأحجام المستخدمة.

 

 

-  يتم سحب 22 ميکرومول من المزيج بماصّة ووضعها في أنبوب صغير سعة (0.2 مل) , وتحفظ هذه الأنابيب بالجليد لحين إضافة العيّنات.

 

2- بدء الاختبار PCR:

يتم وضع کمية 3 ميکرو مول من عيّنة الدنا المأخوذة لأجل الاختبار في الأنابيب السابقة سعة (0.2 مل) الحاوية على مزيج التفاعل , بعدها يتم وضع الأنابيب في جهاز المدور الحراري (thermocycler) (Mastercycler ®, Eppendorf) والذي يتم برمجته وفق النظام التالي في الجدول (3).

 

الجدول 3: النظام الحراري المستخدم في جهاز المدور الحراري.

 

 

وبحسب النظام الحراري أعلاه يتم تضخيم  شدفات محدّدة من الدنا الخاص بجرثوم الکوکسيلّة البورنيتيّة ملايين المرّات ليظهر في المرحلة التالية.

 

3- تحليل النواتج بواسطة الفصل الکهربائي لهلام الأغاروز:

 Analysis of amplified products by agarose gel electrophoresis:

يتم تحضير هلام الأغاروز بترکيز 1.5% بإضافة مايلي:

-     من أجل الکميّة الصغيرة من الهلام يتم إضافة 60 مل من محلول (1X TAE or TBE 1X) يتم إضافة 0.9 غرام من بودرة  الأغاروز.

-     من أجل الکميّة الکبيرة من الهلام يتم إضافة 100 مل من محلول (1X TAE or TBE 1X) يتم إضافة 1.5 غرام من بودرة  الأغاروز.

-     يتم إذابة الأغاروز في المحلول بوضع الدورق في الميکروييف , ويراعى تبريد المزيج بعدها الى الدرجة 60 درجة مئوية قبل الصّب.

-     يتم الصب في الجهاز الخاص بالصب ويشترط أن تکون الوضعيّة أفقيّة , ويترک الهلام ليتصلّب حتى يصبح لونه کامد (يفقد شفافيّته).

-     يتم صب الدارئ TAE or TBE على الهلام المتصلّب.

-     إن المواد الخاصّة باختبار PCR  تم تجهيزها لکي يتم تصنيفها من خلال الرحلان الکهربائي Electrophoresis على جهاز Parafilm , يتم خلط 15 ميکرو مول من کل عيّنة مع 5ميکرومول من محلول دارئ التحميل (Loading buffer) , وتوضع في داخل الحفر المناسبة داخل الهلام.

-     بشکل مواز يتم إضافة ما يعرف بمعلّم الوزن الجزيئي (Molecular Weight Marker) من نوع Smartladder (Eurogentec, Belgium) , ويمتلک هذا المعلّم 14 شريط يتراوح مابين 200- 100 بيس بير .

-     يتم وصل التيار الکهربائي بعد وضع صينيّة الهلام في جهاز الترحيل.

-     يتم الرحلان لمدّة 15 دقيقة على کمون 20 فولط , ثم لمدة ساعة وربع على کمون 80 فولط, ويستمر الرحلان حتّى تصل سوائل رواسب الصبغة المستخدمة إلى 80% من هلام الأغاروز المستخدم.

-     يتم وضع الهلام في محلول BET (1ميکروغرام / مل) 25 ميکروليتر من المحلول (stock solution) في 250مل من الماء المقطّر مرتين لمدّة عشر دقائق حتّى ساعة واحدة کحد أقصى.

-     يتم رؤية الأشرطة بواسطة جهاز الأشعّة فوق البنفسجيّة (ultra violet (UV) light).

 

4-  قراءة وتحليل اختبار ال PCR:  Reading and interpretation of PCR

لکي يتم تقييم الاختبار من المهم ملاحظة أن عيّنة التحکم الإيجابيّة هي عيّنة اختبار PCR مضخّمة ذات وزن 337 بيس بير (337 bp), وبناءً عليه فأي عيّنة تمتلک شريط على نفس المستوى تعتبر إيجابيّة , بينما الآثار المتوافقة مع عيّنات تحکّم سلبيّة بدون DNA  يجب أن لا تحتوي أي شريط.

 

DISCUSSION and RESULTS

النتائــجوالمناقشة

 

کانت النتائج تحتوي على إيجابية عالية فمن أصل (25) عينة مدروسة کانت هناک (17) عينة إيجابية بنسبة إصابة قدرها (68%) , و(8) عيّنات سلبيّة بنسبة قدرها (32%), مع العلم أنه تم أخذ هذه العينات من مناطق متعددة في منطقة حماه وريفها ومع العلم أيضاً أن البعض من المسحات المهبليّة  التي شملتها الدراسة کانت قد أخذت من سيّدات تعرضن مسبقاً لأکثر من إجهاض, وتبيّن الصورة التالية (1) مثالاً عن عيّنات تمّ أخذها والکشف عنها باختبار ال PCR :

 

 

الصورة (1): نتيجة اختبار الکشف عن جرثوم الکوکسيلّة البورنيتيّة باختبار PCR حيث تکون العيّنة الإيجابيّة هي عيّنة اختبار PCR مضخّمة ذات وزن (337 bp)  حسب ما يشير اليه السهم               (الباحث).

 

وعلى اعتبار أن نسبة الإصابة بالحمى المجهولة في هذه الدراسة کانت (68%) فقد تم حساب الخطأ المعياري في هذه النسبة وفقاً للقانون التالي رقم (3):

 

 

حيث أن القيمة (p=0.68) تعبر عن نسبة انتشار الحمى المجهولة في المجموعة البشرية المدروسة, وبالنتيجة فقد کانت قيمة الخطأ المعياري (0,07 ),وتم حساب دقة النتائج من خلال حساب ما يدعى بحد الثقة للنسبة المئويةThe Confidence Interval for aProportion حيث أن حد الثقة لنسبة حيوانات الدراسة يحسب من خلال إضافة وطرح النسبة المئوية للعينة (p) مضروباً بالخطأ المعياري وهکذا فإن حد الثقة 95% لنسبة حيوانات الدراسة يمکن أن يقدر من خلال القانون التالي رقم (2) :

 

 

 

تم حساب قيمة الخطأ المعياري (0,07   ) وبناءً على القانون السابق وعلى اعتبار أن قيمة p = 0.68 فقد تم حساب حد الثقة وکان کما يلي:

(حد الثقة 95% الأعلى =0.77, حد الثقة 95% الأدنى =0.47)

 ثم دققت النتائج من خلال استخدام نظمAccess , وتم تصدير هذه البيانات لإجراء التحاليل الإحصائية والوبائية في نظام Statistics (Analytical Software@1998) النسخة 2.0.

 

تم التوصّل إلى نتائج اختبار PCR للعيّنات البشريّة التي تم أخذها, وبحساب بسيط لنسبة توزّع الإصابة بين الجنسين الذکور والإناث بحسب عشوائيّة أخذ العيّنات فقد تم الحصول على النتائج الموضّحة في الجدول التالي (4):

 

الجدول 4: التکرار المطلق والنسبة المئوية للإصابة بالحمى المجهولة عند مجتمع الدراسة.

 

ويبيّن المخطط التالي 1: البيانات السابقة التي توضّح نسبة توزّع الإصابة بالحمّى المجهولة بين الإناث والذکور.

 

 

 

 

المخطط (1): نسبة توزّع الإصابة بالحمّى المجهولة بين الإناث والذکور

 

وبالنسبة لتوزّع النتائج بحسب نوع العيّنات فقد تم الحصول على النتائج الموضّحة في الجدول التالي (5):

 

الجدول 5: التکرار المطلق والنسبة المئوية للإصابة بالحمى المجهولة بحسب نوع العيّنات عند مجتمع الدراسة.

 

 

ويبيّن المخطّط التالي 2: البيانات بالنسب المئويّة لنسبة الإصابة بالحمّى المجهولة حسب نوع العيّنة المأخوذة.

 

 

 

 

 

 

 

 

المخطّط (2): البيانات بالنسب المئويّة لنسبة الإصابة بالحمّى المجهولة حسب نوع العيّنة المأخوذة

 

 

وبالنسبة للعلاقة بين الإجهاض والحمّى المجهولة فقد تم التوصّل للجدول التالي (6) الذي يبيّن عدد ونسبة الحالات الإيجابيّة والسلبيّة للإجهاض ولاختبار PCR.

 

الجدول 6: الذي يبيّن عدد ونسبة الحالات الإيجابيّة والسلبيّة للإجهاض ولاختبار PCR.

 

 

ويبيّن المخطّط 3: العلاقة بين الإجهاض والحمّى المجهولة کما يلي.

 

 

 

 

المخطّط (3): العلاقة بين الإجهاض والحمّى المجهولة

 

حيث يبدو بوضوح وجود علاقة بين الإجهاض والإصابة بالحمّى المجهولة (20%) ويؤکّد على صحّة هذه العلاقة ارتفاع المقياس المعبّر عن العيّنات سلبيّة الإجهاض والسلبيّة لإختبار PCR (16%).

 

بحسب هذه الدراسة التي تعد الأولى من نوعها في الجمهوريّة العربيّة السوريّة على مستوى الکشف عن مرض مشترک کالحمّى المجهولة عند البشر فقد تمّ الکشف عن العامل المسبّب للمرض وهو الکوکسيلّة البورنيتيّة في العيّنات المتنوعة التي أتيح أخذها للباحثين وذلک بالاعتماد على اختبار تفاعل سلسلة البوليميراز (Polymerase Chain Reaction) PCR والذي يعتبر أحد أهم الاختبارات المعتمدة للکشف عن مرض الحمّى المجهولة بحسب منظمة الصحّة الحيوانيّة العالميّة ( OIE Terrestrial Manual 2010 ) وبناءً على ما سبق فقد تبيّن أنّ نسبة الإصابة بالحمّى المجهولة في العيّنات التي بلغ عددها 25 عيّنة کانت مرتفعة للغاية حيث بلغت (68%) وهذه النسبة متقاربة بشکل کبير مع دراسة وبائيّة مصليّة أجريت في هولندا بين الأعوام 1968-1983 وذلک للکشف عن الحمّى المجهولة حيث تم التوصّل إلى وجود انتشارات مصليّة في مجموعات عالية الخطورة عبارة عن الأطباء البيطريين الحقليين ومحنطي الحيوانات Taxidermists والنساء العاملات في صناعة الأصواف حيث تبيّن بنتيجة هذه الدراسة أن نسبة الانتشار المصلي للحمّى المجهولة قد بلغت 76%.

 

 (Richardus et al., 1985; Houwers and Richardus, 1987; Richardus et al., 1987) , وفي دراسة مصليّة في إقليم النيل الأعلى جنوب السودان کان الانتشار المصلي مخالفاً لنتائج دراستنا في التجمعات البشرية بنسبة %39 (Reinthaler et al., 1988) , وقد کانت نسبة الإصابة عند الذکور أعلى من الإناث في الدراسة 1/1.12 (32%,36%) , وهذا يتوافق مع دراسة تمّت في هولندا تفوّق الرجال على النساء فيها  بنسبة الإصابة حيث کانت نسبة لإصابة النساء بالنسبة للرجال 1/1.7 (Schimmer et al., 2008). بينما لوحظ وجود علاقة بين وجود إجهاض ووجود نتيجة إيجابيّة لاختبار PCR حيث تم استخدام معامل الارتباط بيرسون (CORRELATIONS (PEARSON للکشف عن العلاقة وتبيّن أنها معنويّة قويّة (P-VALUE = 0.0249) وللتوضيح فقد شمل هذا الاستقصاء ثماني سيّدات أخذت منهن مسحات مهبليّة للکشف عن الحمّى المجهولة وتمّ حساب القيمة P-VALUE بالاعتماد على برنامج  Statistics, وفي هذه الدراسة کانت نسبة السيدات اللاتي أثبت اختبار pcr وجود الکوکسيلة البورنيتية لديهن عالية للغاية حيث بلغت (64.28% ) (9 من أصل 14 سيدّة) بينما کانت النسبة أقل من ذلک بکثير في دراسة تمّت في مدينة لندن في العام 2009 من قبل الباحثين (Baud, et al., 2009) حيث التماس مع المجتمع الحيواني بأقل ما يمکن وقد وجد هؤلاء أن نسبة (4,6%) من النساء المشمولات بالدراسة إيجابيات مصلياً لاختبار التألق المناعي غير المباشر (Indirect Immunofluorescence) وذلک للکشف عن أضداد الکوکسيلة البورنيتية عندهن , ويمکن تفسير هذه الاختلاف الکبير بعاملين الأوّل هو الاختلاف في الاختبار الذي تم الاعتماد عليه  للکشف عن الحمّى المجهولة , والأمر الآخر هو الاختلاف في طريقة أخذ العيّنات بين الحالتين ففي لندن کانت الطريقة عشوائيّة غالباً من نساء حوامل لاعلى التعين, وفي هذه الدراسة کانت العيّنات شبه مستهدفة.

 

CONCLUSIONS and RECOMMENDATION

الاستنتاجات والتوصيات

 

مرض الحمى المجهولة الذي تسببه جراثيم الکوکسيلة البورنيتية هو مرض موجود عند البشر في  المنطقة الوسطى من القطر العربي السوري.

نسبة انتشار المرض مرتفعة بشکل کبير وواضح.

 

لوحظ وجود علاقة بين وجود إجهاض ووجود نتيجة إيجابيّة لاختبار PCR وقد تبيّن أنها معنويّة قويّة ( P-VALUE = 0.0249 ).

إن نسبة انتشار المرض المرتفعة تجعلنا ندق ناقوس الخطر عند الجهات المهتمة بانتشار الأمراض الوبائية, وبخاصة أن مرض الحمى المجهولة هو مرض مشترک يصيب الإنسان والحيوان, ويسبب اضطرابات صحية تبدأ بالتوعک الصحي غير الملحوظ وتنتهي بالوفاة في بعض الحالات.

 

REFERENCES

المراجــع

 

العمر أنور . التقصي المصلي عن وجود الکوکسيلا بورنيتي عند الأغنام في المنطقة الوسطى. بحث منشور في مجلّة جامعة البعث , 2011.

 

Alsaleh, A.; Pellerin, J-L.; Rodolakis, A.; Larrat, M.; Cochonneau, D.; Bruyas, J-F. and Fieni, F. (2011): Detection of Coxiella burnetii, the agent of Q fever, in oviducts and uterine flushing media and in genital tract tissues of the non pregnant goat. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis, 34:355-360.

Alton, G.G.; Jones, L.M. and Pietz, D.E. (1975): Laboratory techniques in brucellosis. 2nd ed. World Health Organization. Geneva.

Alton, G.G.; Jones, L.M.; Angurs, R.D. and Verger, J.M. (1988): Techniques for the Brucellosis Laboratory. INRA. Paris, France.

Anette-Bøtner, Donald Broom;Marcus G. Doherr; Mariano Domingo,; Jörg Hartung; Linda Keeling; Frank Koenen; Simon More; David Morton; Pascal Oltenacu; Albert Osterhaus; Fulvio Salati; Mo Salman; Moez Sanaa; James M. Sharp; Jan A. Stegeman; Endre Szücs; Hans-H. Thulke; Philippe Vannier; John Webster and Martin Wierup (2010): EFSA (EUROPEAN FOOD SAFETY AUTHORITY). Panel on Animal Health and Welfare (AHAW); Scientific Opinion on Q Fever. EFSA Journal, 8 (5), 1595, 114 pp. doi: 10.2903/j.efsa. 2010.1595.

Arricau-Bouvery N. and Rodolakis A. (2005): Is Q fever an emerging or re-emerging zoonosis? Vet. Res., 3, 327–349.

Baud, O. Peter; Langel, C.; Regan, L. and Greub, G. (2009): Seroprevalence of Coxiella burnetii and Brucella abortus among pregnant women Journal Compilation (2009). European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, CMI, 15, 496–501.

Blasco, J.M. (1998): A review of the use of Coxiella burnetii Vaccine in adult sheep and goats. Prev. Vet. Med. 34: 160-183.

Boschini, A.; Di Perri, G. and Legnani, D. (1999): Consecutive epidemics of Q fever in a residential facility for drug abusers: impact on persons with human immunodeficiency virus infection. Clin Infect Dis; 28: 866–72.

Carrieri, MP.; Tissot-Dupont, H. and Rey D. (2002): Investigation of a slaughterhouse-related outbreak of Q fever in the French Alps. Eur J Clin Microbiol Infect Dis; 21: 17–21.

Center of food security and public health studies, (2007):College of Veterinary Medicine lows state university Ames, lows 50011.1

De Alarcon, A.; Villanueva, JL. and Viciana, P. (2003): Q fever: epidemiology, clinical features and prognosis. A study from 1983 to 1999 in the South of Spain. J Infect; 47: 110–16.

Derrick, E. (1973): The course of infection with Coxiella burnetii. Med J Aust; 1: 1051–57.

Derrick E. and fever, Q. (1937): A new fever entity: clinical features, diagnosis and laboratory investigation. Med J Aust; 2: 281–99.

Dupuis, G.; Peter, O.; Pedroni, D. and Petite, J. (1985): Clinical aspects observed during an epidemic of 415 cases of Q fever. Schweiz Med Wochenschr;115: 814–8.

Dupuis, G.; Petite, J.; Peter, O. and Vouilloz, M. (1987): An important outbreak of human Q fever in a Swiss Alpine valley. Int J Epidemiol; 16: 282–87.

Fenollar, F.; Fournier, P.; Carrieri, MP.; Habib, G.; Messana, T. and Raoult, D. (2001): Risk factors and prevention of Q fever endocarditis. Clin Infect Dis; 33: 312–16.

Fournier, P.; Marrie, TJ. and Raoult, D. (1998): Diagnosis of Q Fever. J Clin Microbiol; 36: 1823–34.

Fournier, PE.; Etienne, J.; Harle, JR.; Habib, G. and Raoult D. Myocarditis (2001): A rare but severe manifestation of Q fever: report of 8 cases and review of the literature. Clin Infect Dis; 32: 1440–47.

Hilbink, F.; Penrose, M.; Kovacova, E. and Kazar, J. (1993): Q fever is absent from New Zealand. Int J Epidemiol; 22: 945–49.

Houwers, D.J. and Richardus, J.H. (1987): Infection with Coxiella burnetii in man and animals in the Netherlands. Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. A 267, 30–36.

Kermode, M.; Yong, K.; Hurley, S. and Marmion, B. (2003): An economic evaluation of increased uptake in Q fever vaccination among meat and agricultural industry workers following implementation of the National Q Fever Management Program. Aust N Z J Public Health; 27: 390–98.

Lang, G.H. (1990): Coxiellosis (Q fever) in animals. In: Q Fever. Volume I: The Disease, Marrie T.J., ed. CRC Press, Boca Raton, USA, 23–48.

Lepidi, H.; Houpikian, P.; Liang, Z. and Raoult, D. (2003): Cardiac valves in patients with Q fever endocarditis: microbiological, molecular, histologic studies. J Infect Dis; 187: 1097–106.

Levy, PY.; Carrieri, P. and Raoult, D. (1999): Coxiella burnetii pericarditis: Report of 15 cases and review. Clin Infect Dis; 29: 393–97.

Marrie, T J. (2003): Coxiella burnetii pneumonia. Eur Respir J; 21(4): 713–9.

Marrie, TJ. and Raoult, D. (1997): Q fever—a review and issues for the next century. Int J Antimicrob Agents; 8: 145–61.

Maurin M. and Raoult D. (1999): Q fever. Clin. Microbiol. Rev., 12, 518–553.

McQuiston, JH. and Childs, JE. (2002): Q fever in humans and animals in the United States. Vector Borne Zoonotic Dis; 2: 179–91.

OIE Technical disease (2012): www.oie.int/en/animal health-in-the-world/technical-disease-cards/1.

OIE Terrestrial Manual (2010): Chapter 2.1.12. ; Q fever

Palmer, S R. and Young, S E J. (1982): Q fever endocarditis in Englandand Wales, 1975-1981. Lancet 2: 1448-1449.

Raoult, D. and Marrie, T. (1995): Q Fever. Clin Infect Dis; 20: 489–96.

Raoult, D.; Tissot-Dupont, H. and Foucault C. (2000): Q fever 1985–1998: Clinical and epidemiologic features of 1,383 infections. Medicine (Baltimore); 79: 109–23.

Raoult, D, Mege, JL. and Marrie, T. (2001): Qfever:Queries remaining after Decades of research, in S cheld WM, Craig WA, Hughes JM (eds): Emerging Infections 5. Washington, DC, AmericanSo-ciety of Microbiology Press, 26-56.

Raoult, D.Q. fever: (1996): still a query after all these years. J Med Microbi; 44: 77–78.

Reinthaler, F.F.; Mascher, F.; Sixl, W. and Arbesser, C/H. (1988): Incidence of Q fever among cattle, sheep and goats in the Upper Nile province in southern Sudan. Vet. Rec., 122(6): 137.

Richardus, J.; Donkers, A. and Dumas, A. (1987): Q fever in the Netherlands: a sero-epidemiological survey among human population groups from 1968 to 1983. Epidemiol Infect; 98: 211–19.

Richardus, J.; Dumas, A.; Huisman, J. and Schaap, G. (1985): Q fever in infancy: a review of 18 cases. Pediatr Infect Dis J; 4: 369–373.

Rolain, J.; Mallet, M. and Raoult, D. (2003): Correlation between serum doxycycline concentrations and serologic evolution in patients with Coxiella burnetii endocarditis. J. Infect Dis; 188: 1322–25.

Sawyer, L.; Fishbein, D. and McDade, J. (1987): Q fever: current concepts.Rev Infect Dis; 9: 935–46.

Schimmer, B.; Morroy, G.; Dijkstra, F.; Schneeberger, P.M.; Weers-Pothoff, G.; Timen, A.; Wijkmans, C. and van der Hoek, W. (2008): Large ongoing Q fever outbreak in the south of the Netherlands. Eur. Surveill. 13, 18939.

Sidi-Boumedine, K.; Rousset, E.; Henning, K.; Ziller, M.; Niemczuck, K.; Roest, H.I.J. and Thiery, R. (2010): Development of harmonised schemes  for the monitoring and reporting of Q-fever in animals in the European Union.  EFSA Scientific Report on Question No EFSA-Q-2009-00511., 48 pp.

Tissot-Dupont, H.; Raoult, D. and Brouqui, P. (1992): Epidemiologic features and clinical presentation of acute Q fever in hospitalized patients: 323 French cases. Am J Med; 93: 427–34.

Voth, D.E. and Heinzen, R.A. (2007): Lounging in a lysosome: The intracellular lifestyle of Coxiella burnetii Cellular Microbiology 9 (4): 1829–840.

Wilson, H.; Neilson, G.; Galea, E.; Stafford, G. and O’Brien, M. (1976): Q fever endocarditis in Queensland. Circulation; 53: 680–84.

Article View: 701

PDF Download: 177