ISOLATION OF KLEBSIELLA SPP. FROM SOME MEATS | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Assiut Veterinary Medical Journal | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Article 30, Volume 58, Issue 133 - Serial Number 2, April 2012, Page 1-10 PDF (667.22 K) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Document Type: Research article | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DOI: 10.21608/avmj.2012.173761 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
View on SCiNiTO | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Authors | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
N. SOULEMAN1; A. AL-MARIRI2; I. HAMAD3 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1Plant Biology Department, Faculty of Sciences, University of Damascus, Syria | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2Molecular Biology and Biotechnology Department, Atomic Energy Commession, Syria | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3Ecology Department, Faculty of Sciences, University of Damascus, Syria | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Abstract | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Meats often contains micro-organism which may cause disease, Including Klebsiella spp. Which cause wide range of disease states, notably pneumonia, urinary tract infections (UTIs), and bacteremia. The aim of this study was collected 100 samples of meats (Calf, sheep, chicken) from the meats shops present in the different area in Damascus and countryside in a sterile container, for isolated Klebsiella and growing it on Selective Media to identify and characterize its morphology, biochemical and Molecular Characteristics by using Polymerase chain reaction PCR. Colonies of the microorganisms were counted on difference media then isolated from a selective media. The colonies of Klebsiella isolated are circular, dome-shaped. 3-4 mm diameter with mucoid aspect, stickiness and surrounded by capsule. Our results showed that 46% of examined specimen contained Klebsiella spp.The results showed that it can investigate of Klebsiella in meats samples by biochemical reactions and polymerase chain reaction. In next study we will be produced primers To differentiate between two types of Klebsiella (K. pneumoniae and K. oxytoca). | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Keywords | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Key words: Klebsiella spp; Raw Meats; Biochemical tests; Polymerase chain reaction (PCR) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Full Text | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ISOLATION OF KLEBSIELLA SPP. FROM SOME MEATS
N. Souleman*, A. Al-Mariri** and I. Hamad***
* Plant Biology Department, Faculty of Sciences, University of Damascus, Syria. ** Molecular Biology and Biotechnology Department, Atomic Energy Commession, Syria. *** Ecology Department, Faculty of Sciences, University of Damascus, Syria. ___________________________________________________________________________ ABSTRACT ___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________ Key words: Klebsiellaspp., Raw Meats, Biochemical tests, Polymerase chain reaction (PCR). ___________________________________________________________________________
عزل جراثيم الکلِبْسيلَّة Klebsiella SPP.من بعض اللحوم
نور سليمان، أيمن المريري ، ابتسام حمد
تحتوي اللحوم على کائنات حية دقيقة منها ما يسبب الأمراض. ومن ضمنها الکلِبْسيلَّة Klebsiella spp.والتي يمکن أن تُسبب العديد من الحالات المرضية، ولاسيَّما الالتهاب الرئوي، إنتانات المسالک البولية، وتجرثم الدم. يهدف هذا البحث إلى جمع 100 عينة من عينات اللحوم (عجل، ضأن، دجاج) من متاجر بيع اللحوم في دمشق وريفها، في أوعية معقمة، لعزل الکليبسيلة وزراعتها على أوساط انتقائية وتحديد صفاتها المورفولوجية والحيوية الکيميائية والجزيئية باستخدام التفاعل السلسي للبوليمراز PCR. تم إحصاء عدد المستعمرات بعد زرع اللحوم على أوساط مختلفة، وثم تمّ عزلها على وسط انتقائي. ظهر شکل مستعمرات الکلِبْسيلَّة المعزولة دائرية محدبة قطرها 3-4 مم، ذات حواف مخاطية ولزجة، وتکون محاطة بمحفظة. وقد أظهرت النتائج أن حوالي 46% من العينات المدروسة تحوي جراثيمالکلِبْسيلَّة. أظهرت النتائج أنه يمکن التحري عن الکلِبْسيلَّة في عينات اللحوم بواسطة التفاعلات الحيوية الکيميائية وبواسطة التضخيم السلسلي للبوليمراز، وقد يتم في دراسة لاحقة انتاج مرئسات نوعية للتتميز بين نوعين من جراثيم الکلِبْسيلَّة، النوع الرئوي والنوع المُعَجل للولادة.
الکلمات المفتاحية: الکلِبْسيلَّة، اللحوم، الاختبارات الحيوية الکيميائية، التفاعل السلسلي للبوليميراز PCR.
INTRODUCTION المقدمــة
تعد اللحوم من أکثر أنواع الأغذية عرضة للفساد بسبب سهولة نمو الأحياء الدقيقة فيها، وخاصة الجراثيم التي يمکن أن تغزو اللحوم من مصادر مختلفة، فقد تکون من مصدر حيواني داخلي؛ فهي توجد ضمن الجهاز الهضمي للحيوان خاصة (القولون)، وعلى الجلد وغيرها، أو تکون من مصدر خارجي عن طريق مهاجمتها للذبيحة بعد ذبح الحيوان. وما ان تصل هذه الأحياء إلى اللحم حتى تجد الوسط الملائم للنمو والتکاثر، نظراً لأنه يحتوي على العديد من العناصر الغذائية الضرورية لنموها. لذلک من المهم التحري عن وجود أنواع من الجراثيم الممرضة في اللحوم، مثل: الايشريشيا القولونية E. coli والشيغيلةShigella والسالمونيلة Salmonella والکلِبْسيلَّة Klebsiella التي هي هدف دراستنا.
سميت الکلِبْسيلَّة Klebsiella من قبل عالم الأحياء المجهري الألماني إدوين کليبس (1834-1913)، وهي جراثيم عصوية، تتراوح أبعادها من (µm0.1-3(0.6-6.0 µm) x (0.، سالبة الغرام، محاطة بمحفظة، تترتب بشکل مفرد، أو أزواج، أو سلاسل قصيرة، تتوافق مع التعريف العام لفصيلة الإمعائيات Enterobacteriaceae، ماعدا الکلِبْسيلَّة وبيليس K. mobilis ، لا هوائية اختيارية (Garrity, 2005)، غير متحرکة، تخمر اللاکتوز، موجبـة اليوريـاز، غير منتجـة لغـاز کبريت الهيدروجين H2S، مستعمراتها مخاطية، وأحيانا تکون لزجة ملتصقة بسطح الآجار (Guetta et al., 2003). تُفرز الکلِبْسيلَّة ذيفاناً داخلياً متحملاً للحرارة نسبياً، ونذکر من أهم الأعراض السريرية التي يحرضها الذيفان الداخلي: الحمى، وتحرير وسائط الالتهاب، واستنزاف بروتينات المتممة، إضافةً إلى فرط ضغط الدم (Dokladny et al., 2010)، کما أنها تفرز أنزيم يورياز (Urease) الذي يلعب دوراً هاماً في آفة الجهاز البولي، حيث يقوم بحلمهة البولة إلى أمونيا وغاز ثاني أوکسيد الکربون (CO2)، مما يؤدي إلى تحول فوسفات المغنزيوم إلى مرکب مشبع وتحـول فوسفـات الکالسيوم إلى الشکل البلوري مما يُسَبِّب حدوث خلل وظيفي في الکلية وهو أحد مظاهر الالتهابات في الجهاز البولي؛ وبهذا تعتمد إمراضية الکلِبْسيلَّة على النمط الجرثومي وعوامل الفوعة (Augustin et al., 2009). إن الغالبية العظمى من الإصابات بهذه الجراثيم ترتبط بعدوى المستشفيات وتشير الدراسات العلمية أن الکلِبْسيلَّة تسبب حوالي 8% من حالات العدوى الجرثومية في المستشفيات، في الولايات المتحدة الأمريکية وأوروبا (Brooks et al., 2004)، حيث تُصيب وبالدرجة الأولى المرضى في المستشفيات الذين يعانون من نقص في المناعة، الأطفال، مرضى السکري، المدمنين على الکحول، والذين يعانون من انسداد رئوي مزمن (Anderson et al., 2006)، وقد وضعت الکلِبْسيلَّة بين ثمانية من أهم مسببات العدوى بالمستشفيات إذ تأتي بالمرتبة الثانية بعد الإيشيريشيا القولونيةE. coli (Anonymous, 2002). هناک 7 أنواع مختلفة من جراثيم الکلِبْسيلَّة التي تبدي تشابهاً في الـحمض النووي DNA (Garrity, 2005). ومن أکثر هذه الأنواع أهميةً من الناحية الطبية هي الکلِبْسيلَّة الرئوية K. pneumoniae، حيث تُعد من أهم الممرضات سريرياً من بين الإمعائيات، وبدايةً عُرِفَت بأنها تُصيب جهاز التنفس، مسببة الالتهاب الرئوي بشکل أساسي، ويمکن أن تؤدي إلى التهاب واسع النطاق، ومن ثم النزف فالموت (Rosen et al., 2008). تليها الکلِبْسيلَّة المُعجِلة للولادة K. oxytoca التي تُشبـه الرئوية بکونها تُحْدِث آفة في الجهـاز التنفسـي، وتسبب التهـاب الغشـاء المخاطي الأنفي، والدم والتهاب الأذن الوسطى القيحي الحاد (Bleich et al., 2008). يتميز النوع المُعجل للولادة عن باقي الأنواع بکونه ايجابي الأندول کما أن لها خصائص نمـو مختلفـة قليلاً حيث أنهـا يمکـن أن تنمـو على وسـط يحـوي Melezitose ولا تنمو على وســط يحــوي 3-hydroxybutyrate بينما ينمو عليه النوع الرئوي Högenauer et al., 2006)). تعد جراثيم الکلِبْسيلَّة (الرئوية والمُعجِلة للولادة) من العوامل الممرضة الانتهازية التي تسبب للإنسان أمراضاً خطيرة قد تؤدي إلى الوفاة. فقد تسبب التهابات رئوية حادة لمرض ذات الرئة، إنتانات بولية وتناسلية وهضمية، التهاب القولون، تجرثم الدم Bactermia، وفي حالات نادرة تسبب التهاب السحايا (Rodrigues, 2008).
MATERIALS and METHODS مواد البحث وطرائقه
1- المواد: أوساط الاستنبات والزرع: ماء الببتون الموقي Buffered Pepton Water (BPW)، وسط ايوسين ميثيلين بلو آجار Eosin Methylen blue Agar (EMB) Agar، وسط ماکونکي آجار MacConkey Agar، وسط سيمون سترات Simon citrat، وسط لوريا بيرتان Luria Bertani Agar (LB)، وسط مانيتول سولت آجار Manitol Salt Agar (MSA)، ومنمي عام مع الصاد الحيوي الفانکومايسين LB+Van 25 mg/ml)).
مواد الاختبارات الحيوية الکيميائية: ماء أوکسجيني (3%)، ستريبات أوکسيداز (BD,USA) BBLTMDrySlideTM، KOH، ألفا نفتول، أحمر الميتيل، وسط MR-VP، کاشف الأندول Indole test reagent (Ehrlich Kovacs). وسط Ttriple Sugar Iron Agar، وسط(SIM) Sulfur reduction-Indole production- Motility ، وسط MacConkey Agar، وسط Simon citrat، أملاح التترازوليوم Tetrazolium Salts.
مواد عزل الجينوم الجرثومي: الوقاء TE (10mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA pH 8.0)، SDS 10%، بروتيناز K 20mg/ml، NaCl 5M، CTAB NaCl، کلوروفورم إيزوأميل الکحول (24:1)، فينول کلوروفورم إيزوأميل الکحول (25:24:1)، إيزوبروبانول، إيتانول 70%.
مواد التفاعل السلسلي للبوليميراز والرحلان: وقاء PCR 10X(200mM Tris-HCl pH8.8, 100mM KCl,100mM (NH4)2SO4, 1mg/ml BSA, 1% Triton)، MgSO4، نکليوتيدات (dCTP, dATP, dTTP, dGTP)، أنزيم DNA بوليميراز، مرئسات نوعية الجدول [1]، هلامة الآجاروز 1.5% (W/V)، الوقاء 1X TAE المحضر من الوقاء 50X TAE (0.4M Tris-Base, 10mM EDTA pH 8.0, 57.1 ml Glacial Acetic Acid ).
مادة الحفظ: غليسيرول 50%.
2- الطرائق: 2- 1 جمع العينات Sample collection: بلغ عدد العينات 100 عينة، من اللحوم (عجل، ضأن، دجاج). وقد جُمِعَت من مناطق مختلفة من دمشق وريفها.
2-3 معالجة العيناتSample processing : بعد بعد سحق 0.5 غ من العينة المدروسة: تم الاستنبات الأولي غير الاصطفائي في وسط ماء البيبتون الموقي Buffered Peptone Water (BPW) في الدرجة 37°م لمدة 24 ساعة.
2-4 مراحل العمل:
قبل التحري عن وجود الکلِبْسيلَّة في عينات اللحوم، نقوم بإجراء التعداد الکلي للإمعائيات وللکلِبْسيلَّة على وسط ايوسين ميثيلين بلو آجار EMB، وإجراء التعداد العام الکلي للجراثيم على وسط منمي عام هو لوريا بيرتان آجار Luria Bertani Agar (LB) ومنمي عام مع الصاد الحيوي الفانکومايسين LB+Van 25 mg/ml)) لتنمية سلبيات الغرام دون ايجابيات الغرام، ووسط مانيتول سولت آجار (MSA) Manitol Salt Agar لتنمية ايجابيات الغرام.
يتضمن زرع جراثيم الکلِبْسيلَّةKlebsiella spp. عدة مراحل:
1- مرحلة الاستنبات الأولي: تم سحق 0.5 غ من العينة وتنميتها في 4.5 مل من ماء الببتون الموقي (BPW) بالدرجة 37°م لمدة 24 ساعة.
2- مرحلة الاستنبات الاصطفائي: حيث يؤخذ 10 μl من الوسط السابق ويتم زرعها على وسط ايوسين ميثيلين بلو أجار (EMB)، ثم تحضن بالدرجة 37°م لمدة 24 ساعة. وللحصول على هذه الجراثيم نقيةً تؤخذ مستعمرة مفردة وتزرع على وسط ايوسين ميثيلين بلو آجار (EMB) وتکرر هذه العملية حتى نحصل على طبق يحوي مستعمرات نموذجية فقط.
3- توصيف المستعمراتColony characteristics: تبدو مستعمرات الکلِبْسيلَّة النموذجية على وسط ايوسين ميثيلين بلو آجار (EMB): کبيرة قطرها بين (3- 4 مم)، محدبة الشکل، مخاطية، غامقة بنفسجية ذات هالة وردية. تُنتقى هذه المستعمرات من أجل تلوينها.
4- الفحص المجهري:
يُحضر الغشاء الجرثومي ثم يُلون بواسطة طريقة غرام، کالتالي:
يُغمر الغشاء بمحلول 30% من صبغة الفوکسين القاعدية، وتُمرر الصفيحة فوق اللهب حتى يبدأ الملون بالتبخر.
2-5- التفاعل السلسلي للبوليميراز PCR: أُجرِي التفاعل السلسلي للبوليمراز (PCR) على المستعمرات النموذجية النامية على وسط ايوسين ميثيلين بلو آجار (EMB) بعد عزل الجينوم الجرثومي لها وفق مايلي:
أُجري التفاعل السلسلي للبوليميراز PCR على الدنا DNA المعزول من باستخدام البادئات النوعية الموضحة في الجدول رقم [1].
الجدول رقم 1: البادئات النوعية المستخدمة لجنس الکلِبْسيلَّة.
أُجري التفاعل بحجم 25 µl ويوضح رقم [2] المواد المستخدمة في التفاعل، في حين يوضِّح الجدول رقم [3] الشروط اللازمة لحدوث هذا التفاعل.
الجدول رقم 2: المواد المستخدمة في تفاعل الـ PCR
الجدول رقم 3: شروط تفاعل الـ PCR
ومن ثم تمَّ الکشف عن نواتج الـ PCR باستخدام هلامة الآجاروز 1.5% (W/V) المحضرة في الوقاء 1X TAE والترحيل على فولطية 85 V لمدة نصف ساعة.
تمَّ الاحتفاظ بالمستعمرات المؤکدة في الـ BPW مع الغليسيرول 50%، ومن ثم حُفِظت بالدرجة 80-°م من أجل الدراسات اللاحقة.
2-6 الخصائص الحيوية الکيميائية Biochemical Identification: أُجرِيَت على العزلات المؤکدة عن طريق التفاعل الـسلسلي للبوليمرازPCR) ) بأنها کلِبْسيلَّة، الاختبارات الحيوية الکيميائية التالية:
الجدول رقم 4: حالات نمو الجراثيم على وسط ثلاثي سکر الحديد
¨ اختبار أحمر الميتيل: أُجرِيَ بإضافة بضع قطرات من مشعر أحمر الميتيل إلى المُسْتَنْبَت، إذ يدل تغير اللون إلى الأحمر على إيجابية التفاعل (pH الوسط أصغر من 4)، حيث تقوم بعض أنواع الجراثيم بتحويل الغلوکوز أو الديکستروز إلى مرکبات حمضية ثابتة مثل حمض اللبن أو حمض الخل أو حمض النمل وبذلک تتغلب هذه المرکبات الحمضية على الموقي، ويصبح الوسط حمضياً، أما تَغَيُّر اللون إلى البرتقالي (pH الوسط يساوي 7) وإلى اللون الأصفر ( pH الوسط أکبر من 7) فيدلان على أن التفاعل سلبي. ¨ اختبار الفوکس بروسکاوير: أُجرِيَ بإضافة 0.5 مل إلى المستنبت من الکاشف A- هيدروکسيد البوتاسيوم- (KOH) و0.5 مل من الکاشف B- ألفا النفتول- (α-naftol)، إذ يدل تغير اللون إلى الأحمر على إيجابية التفاعل، حيث يکشف هذا الاختبار عن الأحياء المنتجة للأسيتوئين (أسيتيل ميثيل کاربينول) الذي يتأکسد بوجود هيدروکسيد البوتاسيوم إلى دي أسيتيل، والذي يتفاعل بدوره منتجاً اللون الأحمر، أما ظهور اللون النحاسي فيدل على سلبية التفاعل.
RESULTS and SISCUSSION النتائج والمناقشـة
يُوضح الجدول رقم [5] أن التعداد العام للجراثيم أکبر من 109 خلية/مل، وأن التعداد العام للجراثيم سالبة الغرام يتراوح بين 5.4 x 103 إلى 2.7 x 106 خلية/مل؛ بينما کان تعداد الجراثيم موجبة الغرام يتراوح بين 5x102 إلى 7.5x103 خلية/ملللعينات المدروسة. کان تعداد الإمعائيات بين5x102حتى 7.5x103 منها کان تعداد جراثيم الکلِبْسيلَّة من 2.5x 102إلى .1.9x104
الجدول رقم 5: التعداد العام الکلي للجراثيم على أوساط مختلفة
شکلت الکلِبْسيلَّة النامية على الوسط الانتقائي ايوسين ميثيلين بلو آجار EMB مستعمرات کبيرة محدبة مخاطية، ثخانتها حوالي (3.0 µm) وطولها حوالي (1.0 µm)، بلون بنفسجي غامق ذات هالة وردية، بدت الکلِبْسيلَّة تحت المجهر الضوئي بشکل عصيات قصيرة rod-shaped، سالبة لصبغة الغرام، محاطة بمحفظة.
على أساس شکل المستعمرات على الوسط الإنتقائي تم انتقاء 46 عزلة من أصل 100 عينة، يُوضح الجدول رقم [6] نتائج التحري عن Klebsiella في 001 عينة لحم حيث وُجِدت في 46 عينة موزعة على النحو التالي: 23 عينة لحم عجل و14 عينة لحم ضأن و9 عينة لحم دجاج.
الجدول رقم 6: النسبة المئوية لعزلات الکلِبْسيلَّة من عينات اللحوم المدروسة
ثم إجراء التفاعل السلسلي للبوليمراز، حيث يُوضح الشکل رقم [1] تفاعل الـ PCR على المستعمرات النموذجية لتمييز الکلِبْسيلَّة في عينة اللحوم الملوث، وذلک باستعمال البادئات النوعية لجنس الکلِبْسيلَّة (الجدول رقم 1).
الشکل [1] کشف DNA الکلِبْسيلَّة بواسطة الـ PCR
يُلاحظ في المسار 1 هو ناتج PCR لعينة خالية من DNA (شاهد سلبي للتقنية). إن المسارات (2-3-4) هي عصابات دنا الجراثيم المعزولة من عينات اللحوم على أوساط انتقائية، والتي تکافئ في الحجم الجزيئي 1500 أساس آزوتي لعصابة الکلِبْسيلَّة العيارية (حصلنا عليها من مخابر هيئة الطاقة الذرية السورية) الموجودة في المسار 6؛ بينما کان المسار5 نتيجة التقانة الايجابية لعينة Enterobacter sakazakii مع مرئساتها النوعية، مما يؤکد العزل النوعي لجنس الکلِبْسيلَّة من هذه العينات. يُلاحظ من الشکل أنه يمکن استخدام تقنية PCR لتمييز الکلِبْسيلَّة في عينات اللحوم الملوثة. لتحديد الکلِبْسيلَّة المعزولة من عينات اللحوم، تم إجراء الاختبارات الحيوية الکيميائية على کل الجراثيم التي تم نموها على الوسط الانتقائي. حيث بدت معظم الکلِبْسيلَّة المعزولة، غير متحرکة، سالبة الأکسيداز، إيجابية للکاتالاز، مخمرةَ لسکر اللاکتوز، مخمرة لسکريّ الغلوکوز والسکروز، بعض هذه العزلات نمت على وسط سيمون سترات وقلون الوسط، وغير منتجة لغاز کبريت الهيدروجين H2S. أنتجت بعض سلالات الکلِبْسيلَّة المعزولة أنزيم اليورياز، وأثبتت بعض أنواع هذه الجراثيم القابلية على تحليل الحامض الأميني وإنتاج الأندول بعد الحضن بدرجة 37مْ، وکانت من النوع K. oxytoca وهذا يتوافق مع نتائج الدراسات العالمية حول هذه الجراثيم (Garrity, 2005). إن نتائج الاختبارات الحيوية الکيميائية تشير إلى أن الکلِبْسيلَّة المعزولة هي من نوعين مختلفين أو أکثر. تم الحصول على السلالات العيارية المستخدمة في هذه الدراسة من مخبر الميکروبيولوجيا والمناعيات في هيئة الطاقة الذرية السورية، (Kp = K. pneumoniae - *Ko = K. oxytoca*). يُوضح الجدول رقم [7] نتيجة هذه الاختبارات لبعض المستعمرات المعزولة من اللحوم.
الجدول رقم 7: نتائج الاختبارات الحيوية الکيميائية للکلِبْسيلَّة
إنَّ الکلِبْسيلَّة واسعة الانتشار، وهي تمتلک اثنين من البيئات، الأول: تکون في البيئة حيث توجد في المياه السطحية، مياه الصرف الصحي، التربة، وعلى النباتات؛ والثاني: حيث تکون مستعمرة للسطوح المخاطية عند الثدييات (الإنسان، الأبقار، والأغنام...الخ) (Curtis et al., 2008). احتلت منذ سنوات المقام الأول بين أمراض المستشفيات الخمجية الانتهازية، فهي تستطيع أن تسبب خمجاً تالياً في کل آفة (Maltezou et al., 2009). هناک اهتمام کبير عند حدوث الأمراض بسبب جراثيم الکلِبْسيلَّة، حيث تمتلک هذه الجراثيم آليات للدفاع کونها تمتلک مستضدات محفظية K)) المرمزة للمحفظة التي تقاوم عملية البلعمة، وتقاوم درجة الحرارة 100 مْ. کما أنها تملک نظام أنزيمي (مثل الکاتالاز) يُعدّ من آليات الدفاع ضد البالعات الکبيرة، حيث أن البالعات تمتلک المقدرة على إرجاع الأکسجين إلى ماء أکسجيني أو أکسجين فعّال، وتعدّ هاتين الجزيئتين سامتين للجراثيم ولذلک فإن الکاتالاز يحفّز عودتهما إلى أکسجين عادي وماء (Nordmann et al., 2009)، ولذلک تُعدّ الکلِبْسيلَّة موجبة الکاتالاز. لقد أظهرت نتائجنا أنه يمکن التحري عن الکلِبْسيلَّة في عينات اللحوم بواسطة التفاعلات الحيوية الکيميائبة وبواسطة التضخيم السلسلي مستخدمين مرئسات نوعية للمورثة 16sRNA المحافظة ضمن الجنس.
إن تقنية الـPCR لا تستغرق سوى يوم واحد، وهذا يفيد في إمکانية استخدامها کطريقة عيارية في الکشف عن الکلِبْسيلَّة. کما أنها تقنية تجنب العاملين في مخابر الجراثيم من الإصابة بهذه الجراثيم، وهي أسرع وأکثر حساسية من الاختبارات الحيوية الکيميائية ونعتقد أنها ستکون المعتمدة في المستقبـل للتحـري عن الکلِبْسيلَّة في عينات اللحوم (Min Wang et al., 2008). أظهرت الخصائص الشکلية والحيوية کيميائية أن نسبة الکلِبْسيلَّة في اللحوم بمختلف أنواعها 46% وهذا ما يتوافق إلى حد ما معStiles و Lai-King حيث کانت نسبة تواجد الکلِبْسيلَّة ضمن دراستهما 46% (Stiles and Lai-King, 1981). بينما لم تتوافق نتائجنا مع Messaoudi وزملاؤه حيث کانت نسبة الکلِبْسيلَّة في اللحوم 33.3% (Messaoudi et al., 2009). ونعتقد أن سبب الاختلاف في نسبة الفلورا من الکلِبْسيلَّة في البيئة المحيطة بالحيوانات في ألمانيا عنه في سورية. لاحظنا أن عدد الدراسات التي تبحث عن الکلِبْسيلَّة في اللحوم الخام قليل نسبياً وذلک قد يکون بسبب عدم تواجدها ضمن الفلورا الطبيعية للحوم، أو أنه تقليدياً يتم التحري عن الکلِبْسيلَّة ضمن الوجبات السريعة والعينات الطبية لأنها تعتبر من الجراثيم التي تنتقل عبر عدوى المستشفيات. لکن رغم ذلک أظهرت نتائجنا نسبة لا بأس بها من الکلِبْسيلَّة ضمن عينات اللحوم الخام مما يدل على جدوى الدراسة من تطوير اختبار تفريقي للکلِبْسيلَّة ضمن اللحوم؛ کما أنه يجب متابعة البحث لتحديد الفوعة المرضية لهذه العزلات لمعرفة فيما إذا کانت تُساهم في إصابة الجهاز البولي-التناسلي أو الجهاز التنفسي أو حتى تجرثم الدم. وللأسباب السابقة الذکر کان الهدف من دراستنا في التحري عن الکلِبْسيلَّة في عينات اللحوم لکي تکون الخطوة الأولى في دراسة وبائية هذه الجراثيم في محافظتي دمشق وريفها. وحالياً نحن في صدد متابعة أبحاثنا حول اختبار حساسية ومقاومة عزلات الکلِبْسيلَّة المعزولة في مخابرنا لبعض الصادات الحيوية المستخدمة في علاج مرضى الالتهابات الرئوية وتحديد فعاليتها في هذه المعالجة.
الاستنتاجات
لقد أظهرت نتائجنا أنه يمکن التحري عن الکلِبْسيلَّة في عينات اللحوم بواسطة التفاعلات الحيوية الکيميائية وبواسطة التضخيم السلسلي مستخدمين مرئسات نوعية للمورثة 16sRNA المحافظة ضمن الجنس.
REFERENCE
Anderson, D.J.; Engemann, J.J.; Harrell, Carmeli, L.J.Y.; Reller, L.B. and Kaye, K.S. (2006): Predictors of mortality in patients with bloodstream infection due to ceftazidime-resistant Klebsiella pneumoniae. Antimicrob. Agents Chemother., V. 50, pp. 1715–1720. Anonymous, (2002): The cost of antibiotic resistance: effect of resistance among Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, and Pseudomonas aeruginosa on length of hospital stay. Infect. Control Hosp. Epidemiol, V. 23, pp. 106–108. Augustin, A.; Seng Duong, L.; Kalavsky, E.; Liskova, A.; Kisac, P. and Krcmery, V. (2009): Colonization with cefotazime-resistant Enterobacter spp. and Klebsiella spp. in HIV-positive Cambodian children decreases with immune reconstitution after HAART. J. Chemother., V. 21, pp. 232-233. Bleich, A.; Kirsch, P.; Sahly, H.; Fahey, J.; Smoczek, A.; Hedrich, H.J. and Sundberg, J.P. (2008): Klebsiella oxytoca: opportunistic infections in laboratory rodents.Lab Anim., V.42, pp. 369-375. Brooks, S.E.; Walczak, M.A.; Malcolm, S. and Hameed, R. (2004): Intrinsic Klebsiella pneumoniae contamination of liquid germicidal hand soap containing chlorhexidine. Infect. Control Hosp Epidemiol., V. 25, pp. 883–885. Curtis, L.; Nakipoglu, Y.; Kucuker, M.A.; Katranci, H. and Derbentli, S. (2008): Need for more environmental control of Klebsiella and other gram negative infections. Saudi Med J., V.29, pp. 1069. Dokladny, K.; Lobb, R.; Wharton, W.; Thomas, Y. and Moseley, P. (2010): LPS-induced cytokine levels are repressed by elevated expression of HSP70 in rats: possible role of NF-ΚB, Cell Stress Chaperones, V.15, pp. 153–163. Garrity, M. (2005): Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Department of Microbiology and Molecular Genetics, V.2, pp. 716-724. Guetta, O.; Milas, M. and Rinaudo, M. (2003): Structure and properties of a bacterial polysaccharide from a Klebsiella strain (ATCC 12657). Bio. Macro. Molecules., V. 4, pp. 1372-1379. Handling. Applied and Environmental Microbiology, V.41, pp. 867-872. Högenauer, C.; Langner, C. and Beubler, E. (2006): Klebsiella oxytoca as a causative organism of antibiotic-associated hemorrhagic colitis. The New England Journal of Medicine. V. 355, pp 2418-2426. Maltezou, H.C.; Giakkoupi, P.; Maragos, A.; Bolikas, M.; Raftopoulos, V.; Papahatzaki, H.; Vrouhos, G.; Liakou, V. and Vatopoulos, A.C. (2009): Outbreak of infections due to KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae in a hospital in Crete. Journal of Infection, V. 58, pp. 213-219. Messaoudi, A.; Gtari, M.; Boudabous, A. and Wagenlehner, F. (2009): Identification and susceptibility of Klebsiella and Enterobacter spp. isolated from meat products. African Journal of Microbiology Research, V.3, pp. 362-369. Min Wang; Boyang Cao; Qunfang, Yu.; Lei Liu; Qili Gao; Lei Wang and Lu FengJ Clin. (2008): Microbiol Analysis of the 16S–23S rRNA Gene Internal Transcribed Spacer Region in Klebsiella Species. J.clin. Microbiol., V. 46, pp 3555–3563. Nordmann, P.; Cuzon, G. and Naas, T. (2009): The real threat of Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing bacteria. Lancet. Infect. Dis., V.9, pp. 228–236. Rodrigues, P.; Almeida, AM.; Bertoni, BW. And Rclr, P. (2008): Assessment of Genntic relationship between Klebsiella pneumoniae and Klebsiella oxytoca samples isolated from a dental office. J. Venom. Anim. Toxins incl. Trop., V.14, pp. 703-718. Rosen, D.A.; Pinkner, J.S.; Jones, J.M.; Walker, J.N.; Clegg, S. and Hultgren, S.J. (2008): Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infect. Immun., V.76, pp. 3337-3345. Stiles, M. Lai-King, NG., 1981. Enterobacteriaceae Associated with Meats and Meat. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
REFERENCE
Anderson, D.J.; Engemann, J.J.; Harrell, Carmeli, L.J.Y.; Reller, L.B. and Kaye, K.S. (2006): Predictors of mortality in patients with bloodstream infection due to ceftazidime-resistant Klebsiella pneumoniae. Antimicrob. Agents Chemother., V. 50, pp. 1715–1720. Anonymous, (2002): The cost of antibiotic resistance: effect of resistance among Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, and Pseudomonas aeruginosa on length of hospital stay. Infect. Control Hosp. Epidemiol, V. 23, pp. 106–108. Augustin, A.; Seng Duong, L.; Kalavsky, E.; Liskova, A.; Kisac, P. and Krcmery, V. (2009): Colonization with cefotazime-resistant Enterobacter spp. and Klebsiella spp. in HIV-positive Cambodian children decreases with immune reconstitution after HAART. J. Chemother., V. 21, pp. 232-233. Bleich, A.; Kirsch, P.; Sahly, H.; Fahey, J.; Smoczek, A.; Hedrich, H.J. and Sundberg, J.P. (2008): Klebsiella oxytoca: opportunistic infections in laboratory rodents.Lab Anim., V.42, pp. 369-375. Brooks, S.E.; Walczak, M.A.; Malcolm, S. and Hameed, R. (2004): Intrinsic Klebsiella pneumoniae contamination of liquid germicidal hand soap containing chlorhexidine. Infect. Control Hosp Epidemiol., V. 25, pp. 883–885. Curtis, L.; Nakipoglu, Y.; Kucuker, M.A.; Katranci, H. and Derbentli, S. (2008): Need for more environmental control of Klebsiella and other gram negative infections. Saudi Med J., V.29, pp. 1069. Dokladny, K.; Lobb, R.; Wharton, W.; Thomas, Y. and Moseley, P. (2010): LPS-induced cytokine levels are repressed by elevated expression of HSP70 in rats: possible role of NF-ΚB, Cell Stress Chaperones, V.15, pp. 153–163. Garrity, M. (2005): Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Department of Microbiology and Molecular Genetics, V.2, pp. 716-724. Guetta, O.; Milas, M. and Rinaudo, M. (2003): Structure and properties of a bacterial polysaccharide from a Klebsiella strain (ATCC 12657). Bio. Macro. Molecules., V. 4, pp. 1372-1379. Handling. Applied and Environmental Microbiology, V.41, pp. 867-872. Högenauer, C.; Langner, C. and Beubler, E. (2006): Klebsiella oxytoca as a causative organism of antibiotic-associated hemorrhagic colitis. The New England Journal of Medicine. V. 355, pp 2418-2426. Maltezou, H.C.; Giakkoupi, P.; Maragos, A.; Bolikas, M.; Raftopoulos, V.; Papahatzaki, H.; Vrouhos, G.; Liakou, V. and Vatopoulos, A.C. (2009): Outbreak of infections due to KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae in a hospital in Crete. Journal of Infection, V. 58, pp. 213-219. Messaoudi, A.; Gtari, M.; Boudabous, A. and Wagenlehner, F. (2009): Identification and susceptibility of Klebsiella and Enterobacter spp. isolated from meat products. African Journal of Microbiology Research, V.3, pp. 362-369. Min Wang; Boyang Cao; Qunfang, Yu.; Lei Liu; Qili Gao; Lei Wang and Lu FengJ Clin. (2008): Microbiol Analysis of the 16S–23S rRNA Gene Internal Transcribed Spacer Region in Klebsiella Species. J.clin. Microbiol., V. 46, pp 3555–3563. Nordmann, P.; Cuzon, G. and Naas, T. (2009): The real threat of Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing bacteria. Lancet. Infect. Dis., V.9, pp. 228–236. Rodrigues, P.; Almeida, AM.; Bertoni, BW. And Rclr, P. (2008): Assessment of Genntic relationship between Klebsiella pneumoniae and Klebsiella oxytoca samples isolated from a dental office. J. Venom. Anim. Toxins incl. Trop., V.14, pp. 703-718. Rosen, D.A.; Pinkner, J.S.; Jones, J.M.; Walker, J.N.; Clegg, S. and Hultgren, S.J. (2008): Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infect. Immun., V.76, pp. 3337-3345. Stiles, M. Lai-King, NG., 1981. Enterobacteriaceae Associated with Meats and Meat. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Statistics Article View: 1,939 PDF Download: 267 |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||